[发明专利]用于被修饰蛋白分离鉴定的电泳分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种通过电泳分离修饰蛋白与天然蛋白的方法。

背景技术

蛋白质翻译后修饰是蛋白鉴定工作中的一个重要方面。翻译后修饰包括磷酸化、糖基化、螯合金属、N端封闭、二硫键的形成等等。蛋白质一级结构可以从基因序列演绎，但翻译后修饰的信息几乎无法仅从基因序列得到。而众所周知的是，这些修饰对于蛋白质的功能乃至细胞的功能都十分重要，也往往与疾病的发生有关。因此，对不同修饰的蛋白质进行分离和鉴定，在蛋白质组，特别是功能蛋白质组的研究中意义重大。

现有的蛋白修饰鉴定最有效的方法是质谱法，质谱法可通过特征离子检测的方法很快确定磷酸化肽，通过串联质谱确定磷酸化位点。通过质谱、蛋白酶解和糖苷酶酶解相结合的方法寻找糖肽，可以鉴定糖基化位点。

现有的蛋白修饰分离的方法有色谱技术和电泳技术。能分离修饰蛋白的蛋白电泳方法包括2D-PAGE、IEF-PAGE。2D-PAGE电泳是二维电泳，大都是指第一向为等电聚焦(等电点信息)，第二向为SDS-PAGE电泳(分子量信息)，是根据样品带电荷和分子量的不同而分离的。IEF-PAGE电泳是一维电泳，不同样品根据其等电点不同可以分离开来。IEF-PAGE电泳可以分离等电点不同的修饰蛋白和天然蛋白，但不能得到这种蛋白的修饰程度信息。另外，利用制备的特异性单克隆抗体也可以分离某些修饰蛋白；使用荧光探针、同位素特异性标记蛋白的修饰部分，可以分析蛋白被修饰的程度。但这些方法都有各自的缺点，成本高、耗时长、污染环境等。

在明确一种蛋白的修饰成分以及修饰位点的前提下，欲将蛋白中的天然蛋白分子和被修饰蛋白分子分离，并确定蛋白的被修饰程度，上述几种方法中，只有2D-PAGE电泳能满足要求。但2D-PAGE是二维电泳，对仪器设备要求高，操作复杂。本发明建立了一种一维电泳方法，即Urea-PAGE蛋白电泳法，实现蛋白中的天然蛋白分子和被修饰蛋白分子的分离，并确定蛋白的被修饰程度。 

尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE）是一维电泳，它一直普遍应用于分离单链DNA和RNA，电泳中加入6-8 M Urea，可以使DNA和RNA的二级结构变性。根据分子量的不同分离2-500bp的DNA或RNA。其步骤简单，操作方便，且成本低。

发明内容

本发明建立了针对蛋白中天然蛋白与被修饰蛋白分离的Urea-PAGE蛋白电泳法，提供一种将蛋白中的天然蛋白分子和被修饰蛋白分子进行分离，并根据被修饰蛋白分子所占的比例确定蛋白的被修饰程度的电泳新方法。Urea-PAGE蛋白电泳过程包括配胶、制备凝胶板、上样、电泳、染色、脱色及凝胶成像及结果判读等几个步骤。

本发明所要解决的技术问题通过以下步骤来实现。

1）配置凝胶及缓冲液：a）凝胶溶液：6-8 M尿素，4-8%的丙烯酰胺，其中丙烯酰胺中丙烯酰胺（Acr）：N，N-甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）= 30-40:1，20mM乙二胺四乙酸（EDTA），90mM的 pH8.4的三羟甲基氨基甲烷（Tris）-硼酸以及过硫酸铵（AP）、双蒸水、四甲基乙二胺（TEMED）；b）上样缓冲液：35-50%的蔗糖、6-8M尿素、20mM 乙二胺四乙酸（EDTA）以及90mM的pH8.4的三羟甲基氨基甲烷（Tris）-硼酸；c）电极缓冲液：25mM乙二胺四乙酸（EDTA）、112.5mM的pH8.4的三羟甲基氨基甲烷（Tris）-硼酸。

2)电泳：电泳条件为电压100-180 V，电泳时间4-6小时，凝胶板长度为50-200mm。电泳时采用常规方法冷却，将电泳温度控制在60℃以下。

3)蛋白质分离及修饰的判定：电泳后凝胶经染色，脱色后成像，分析蛋白修饰情况。如果蛋白在SDS-PAGE蛋白电泳中只有一条带，而经此蛋白电泳可分离出两条带，即可判定蛋白有部分被修饰。对照未修饰蛋白，可以判断出修饰蛋白的条带，通过Quality One软件还可以定量出蛋白被修饰的程度。

本发明使用常规的一维蛋白电泳系统，在凝胶中加入Urea使蛋白变性，并通过控制蛋白泳动速率、电泳的时间及电压等因素，将蛋白中的天然蛋白分子和被修饰蛋白分子进行分离。电泳过程中需注意凝胶和上样缓冲液中一定要加Urea使蛋白变性，整个电泳都不能加SDS影响蛋白带电荷量，这是Urea-PAGE蛋白电泳的关键。