[发明专利]抗白斑综合征病毒的转基因藻株及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体地说涉及一种抗白斑综合征病毒的转基因藻株的制备方法，同时还涉及该转基因藻株作为药物和饲料（或饲料添加剂）在实际生产中的应用。

背景技术

   白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus, WSSV）是当前对虾养殖业中毒力最强、传播速度最快、致死率最高的病原体。近年的研究表明，VP28和VP19是WSSV两种重要的囊膜蛋白，二者在病毒感染宿主时起着非常关键的作用。有研究表明：WSSV VP28和VP19囊膜蛋白基因经原核系统（如大肠杆菌）和真核系统（如酵母、家蚕等宿主）表达后，其表达产物具有和天然蛋白相似的生化性质和免疫学活性，对虾体具有很好的免疫刺激效果。如果把VP28和VP19蛋白直接作为疫苗对虾体进行口服免疫，能够显著提高宿主对WSSV的抵抗力，免疫效果较为明显。有研究者进行了VP28+VP19二者基因融合表达的研究，表达的融合蛋白比单独蛋白免疫效果更加明显，能够达到约65%-100%的保护率。

目前，能够用于外源基因表达的载体系统非常多，如转基因植物、转基因动物、动物细胞培养系统、修饰和改造的微生物系统等等。在这些系统中，由于转基因动物和动物细胞培养系统的成本昂贵、蛋白质产物易受到污染、且纯化困难和难以规模化等缺点，限制了二者系统的应用。转基因植物虽具有规模化生产和功能性蛋白质修饰的优点，但其本身和表达产物易造成对环境的污染，造成该系统也存在一定的限制。当前应用较为广泛的隶属微生物表达系统，该表达系统能够克服以上表达系统的不足，但在原核微生物系统（如细菌）不能进行功能性蛋白质的转录和翻译后修饰，且表达产物易形成不溶性的包涵体，也使得原核表达系统的应用得到了限制。动、植物病毒载体系统由于存在向外界环境散毒的可能性，且成本高和目的蛋白纯化难度大，也存在一定的局限性。为此，为了能避免以上载体系统存在的不足，并且能够获得大量的蛋白产物，新型盐藻生物反应器的建立为表达WSSV囊膜蛋白提供了最为理想的结合点。

发明内容

   本发明目的在于提供一种抗白斑综合征病毒的转基因藻株。

本发明另一目的在于提供一种转基因藻株作为药物在预防或治疗白斑综合征病毒中的应用。

本发明再一目的在于提供一种转基因藻株作为饲料或饲料添加剂在甲壳类动物养殖中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案在于提供一种抗白斑综合征病毒的转基因藻株，该转基因藻株是由将抗白斑综合征病毒的基因插入真核表达载体中构成的重组质粒再转化至盐藻细胞中得到。

本发明的技术方案还在于提供一种表达抗WSSV的囊膜蛋白基因的盐藻株的制备方法，步骤如下：

1）WSSV囊膜蛋白基因的制备：取感染WSSV的病料利用低温超速离心法进行病毒的提纯，得到完整WSSV，采用病毒核酸提取试剂盒提取病毒核酸，根据vp28与vp19的序列分别设计引物，以DNA作为模板，采用PCR发分别扩增得到VP28、VP19及VP28+VP19融合基因的基因片段；

2）含WSSV囊膜基因真核表达载体的构建：将克隆得到的囊膜蛋白基因VP28、VP19和VP28+VP19等基因分别与克隆载体连接，通过酶切鉴定和测序鉴定后获得正确的基因片段，然后连接到真核表达载体上，经酶切和测序鉴定正确后，成功构建重组表达载体；

3）将构建好的重组质粒转化盐藻细胞：将构建好的重组质粒通过玻璃珠转化法、基因枪法、电击法、脂质体介导法和超声波导入法转化盐藻细胞，转化后进行选择培养获得阳性转化株；

4）稳定表达抗白斑综合征病毒基因的转基因盐藻株的筛选与鉴定：提取转基因盐藻的基因组DNA和RNA，对目的基因进行PCR和RT-PCR扩增，以鉴定目的基因整合与表达状态。并利用western blot技术对表达产物进行活性和产量的分析。