[发明专利]一种淋巴细胞培养基及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于体外细胞培养技术领域，涉及一种淋巴细胞培养基，另外，本发明还提供了一种淋巴细胞培养基的培养方法。

背景技术

有效的细胞免疫治疗离不开在体外大量培养、扩增和活化淋巴细胞。这其中使用量最大的试剂就是培养基。培养基为淋巴细胞的生长提供了基本的环境，包括为淋巴细胞存活提供适宜的渗透压，PH值，为淋巴细胞的生长提供了一切所需的营养因子，包括无机盐、氨基酸、功能性的蛋白、维生素等，也是淋巴细胞各种代谢产物的排放场所。传统的培养基为了提供这些营养因子，大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，比较常见的有新生牛血清、胎牛血清、人AB血清、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人转铁蛋白等。使用动物血清的优点是有足够的量供应，价格便宜，但是使用动物血清的缺点是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，而且动物血清并不能很好的支持人淋巴细胞的生长。而使用人AB血清的好处是可以很好的支持人淋巴细胞的生长，但是人AB血清来源困难，供应量有限，而且也存在传播传染病的风险。

现有商品化无血清淋巴细胞培养基大都添加有人血白蛋白、人转铁蛋白等人源性组分。由于这些组分来源于人的血清，虽然有各种病原体的检测技术和消毒技术，但仍然避免不了传播疾病的风险；由于来源于不同的供者，造成批次间差异，不利于质量的控制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于现有淋巴细胞培养基大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，增加了传播疾病的风险，同时不同批次，质量无法统一的问题，并针对该问题提供一种淋巴细胞培养基，实验证明，使用本发明所述淋巴细胞培养基用于培养人淋巴细胞的效果与含人源性成分的无血清培养基相当。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：

一种淋巴细胞培养基，包括基础培养基以及血清替代物，其特征在于所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白以及重组人胰岛素。

人转铁蛋白的主要作用是向细胞内转运铁(Fe³⁺)，几乎所有的细胞生长都离不开对铁的需求，在体内转铁蛋白主要由肝脏合成。人血白蛋白是人血浆中含量最多的一种蛋白质，主要起到维持胶体渗透压，储存和运输脂质、激素和微量元素等作用，在体内主要由肝脏合成，胰岛素的主要作用是促进细胞对葡萄糖的摄取，在体内由胰腺分泌。

本发明所述淋巴细胞培养基的成分均没有采用动物或人的血清，从而避免了传播疾病的风险，另外，本发明所用基础培养基是无动物来源的RPMI 1640培养基。优选的，该培养基是不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基。

本发明中重组人血白蛋白是使用酵母、细菌等为载体生产出来的，生产过程中无任何动物来源成分的使用。其使用浓度为0.1mg/L至40mg/L，优选地，其使用浓度为0.5mg/L至10mg/L，更优选地为2mg/L。

本发明中重组人转铁蛋白是使用酵母、细菌等为载体生产出来的，生产过程中无任何动物来源成分的使用。其使用浓度为5mg/L至200mg/L，优选地，其使用浓度为10mg/L至100mg/L，更优选地为50mg/L。

本发明中重组人胰岛素是使用酵母为载体生产出来的药用级的胰岛素，生产过程中无任何动物来源成分的使用。其使用浓度为1mg/L至100mg/L，优选地，其使用浓度为5mg/L至50mg/L，更优选地为10mg/L。

当然，作为淋巴细胞培养基，本发明还向血清替代物添加了脂质、微量元素化合物以及维生素。培养细胞所需要的脂质虽然大部分在细胞内可以合成，但少部分脂质属于细胞不能合成的脂质，需要由外界补充，例如本发明所述添加了的脂质就属于细胞培养需要，但又不能合成的脂质，这类脂质包括亚油酸、亚麻酸、胆固醇等。其中，胆固醇来源为化学合成，亚油酸及亚麻酸来源为植物。在实践中，为增加脂质的溶解度，可以加入助溶剂Tween 80。

而微量元素如铁、锌、硒、铜等是细胞内许多酶的活性中心，也需要以合适的形式补充到培养基中，本发明所述微量元素化合物包括硝酸铁、亚硒酸钠、硫酸铜以及硫酸锌，以向细胞提供铁、锌、硒以及铜。

本发明还向血清替代物中添加了维生素E，以满足细胞培养需要。

为了使本发明所述淋巴细胞培养基发挥良好的效果，本发明对脂质、微量元素化合物以及维生素做了如下限定：

所述淋巴细胞培养基中胆固醇的浓度为0.5mg/L-5mg/L；所述淋巴细胞培养基中亚油酸的浓度为0.05mg/L-0.5mg/L；所述淋巴细胞培养基中亚麻酸的浓度为0.05mg/L-0.5mg/L。