[发明专利]删除转基因植物中抗生素标记基因的系统及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及删除转基因植物中抗生素标记基因的系统及其应用。

背景技术

自转基因技术诞生以来，转基因产品中人们最担心的是安全性问题，转基因产品中带有的一些选择标记基因可能会对人类健康、自然界的物种和环境存在潜在的风险。因此，转基因植物的安全性问题日益受到重视，并已成为影响转基因植物产业健康发展的主要瓶颈(参考文献：Hare P D，Chua N H.Excision of selectable marker genes from transgenic plants.Nature Biotechnology，2002，20：575-580.)。而其中重中之重为抗生素抗性基因问题。转基因食品中的抗生素抗性基因可能会通过转染肠道细菌，而使人类对这些抗生素产生抗性，也就是耐药性。联合国粮农组织和世界卫生组织在2003年联合颁布的转基因植物食品风险评估准则明确指出：“对在临床上应用的抗生素具有抗性的耐抗生素基因不应在食品中出现”。卡那霉素抗性基因对卡那霉素具有抗性，被世界卫生组织列为第二级别，为重要类抗生素，意味着该抗生素抗性基因不应在食品中出现。因此抗生素抗性基因的删除具有重要意义。

Cre/loxP重组系统由于特异、高效、作用专一性强，因而不影响基因的正常表达与调控，在转基因研究中得到了广泛的应用(参考文献：Ballester A，Cervera M，Pena L.Efficient production of transgenic citrus plants using isopentenyl transferase positive selection and removal of the marker gene by site-specific recombination.Plant Cell Reports，2006，26：39-45.和Cao M X，Huang J Q，Yao Q H，Liu S J，Wang C L，Wei Z M.Site-specific DNA excision in transgenic rice with a cell-permeable Cre recombinase.Molecular Biotechnology，2006，32：55-63.和Chakraborti D，Sarkar A，Mondal HA，Schuermann D，Hohn B，Sarmah BK，Das S(2008)Cre/lox system to develop selectable marker free transgenic tobacco plants conferring resistance against sap sucking homopteran insect.Plant Cell Rep 27：1623-1633.和Cuellar W，Gaudin A，Solorzano D，Casas A，Nopo L，Chudalayandi P，Medrano G，Kreuze J，Ghislain M.Self-excision of the antibiotic resistance gene nptII using a heat inducible Cre-loxP system from transgenic potato.Plant Molecular Biology，2006，62：71-82.)。Cre(causes recombination)重组酶是由来源于P1噬菌体的cre基因所编码的一类酶，属于Int家族，识别特异靶位点(loxP位点)并催化在该位点断裂和重组(参考文献：Stembergn，Sauer B，Hoess R，et al.Bacteriophage P 1cre geneand its regulatory region evidence formultiple promoters and for regulation by DNA methylation[J].Journal of Molecular Biology，1986，187：197-121.)。loxP位点是一段长度为34bp的DNA序列，是Cre重组酶的特异性识别位点，具有典型的回文结构，由两个13bp的反向重复序列和中间8bp的不对称间隔区组成，8bp的间隔区负责位点的定向(参考文献：Ronald H H，Marcia Z，Nat S.P1 site2specific recombination：nucleotide sequence of recombining sites[J].Proc NatlAcad Sci，USA，1982，79：3398-3402.)。当同一条DNA分子上有2个同向的loxP位点时，Cre重组酶催化两个loxP位点间基因的剔除，只留下1个loxP位点，重组发生在8bp的分隔区内(参考文献：Hoess R H，Abremski K.Interaction of the bacteriophage P1 recombinase Cre with the recombining site loxP.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1984，81：1026-1029.)。Cre重组酶介导的DNA重组不受切除片段长度和位置的限制，只要靶基因被2个识别位点标记就可以准确地进行DNA重组。