[发明专利]一种耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体和应用

说明书

技术领域

 本发明涉及一种耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体和其在涤纶纤维改性中的应用，属于基因工程和酶工程领域。 

背景技术

涤纶作为当今世界的三大合成纤维之一，与天然纤维相比，表现出良好的物理性能（如强度、弹性、韧性、硬度和耐磨性等）、染色性能和耐高温、耐化学品等特性。然而，由于涤纶纤维是疏水性纤维，其结晶度高，吸湿性差，且易起静电，不仅影响穿着舒适性，而且还限制了复合物改性剂、着色剂、阻燃剂等在加工处理过程中的应用。因此，为了达到优良的润湿性和染色效果，必须对涤纶纤维进行改性。目前，国内采用传统的强碱性或酸性剂处理方法不仅需要消耗大量的能源和化学品（粘合剂，偶联剂等），而且对生态环境造成了严重威胁。相比于化学改性，生物酶应用于纤维改性是提高合成纤维质量和加工性能的有效途径，顺应了纤维改性工业可持续发展的要求。

角质酶是一种多功能的水解酶，它不仅水解植物表皮的角质层，也能水解很多酯类结构包括甘油三酯和合成聚酯等。近来，角质酶在涤纶纤维改性中有潜在的应用价值。然而，角质酶处理大分子聚酯类底物（如涤纶）时存在亲和力差、可及度低的问题，大大降低角质酶的作用效果。国外对角质酶的研究主要集中于真菌来源角质酶，但真菌角质酶热稳定性差，也不适合于纺织工业中的应用。

本实验室研究开发的嗜热子囊菌（Thermobifida fusca）可产耐热角质酶，并能有效水解角质、PET等聚酯（陈坚, 吴敬, 陈晟. 一种耐热角质酶及其编码基因和表达. 申请号200710026074.2）。另外，我们采用一种新方法将纤维素结合域（CBD）融合到角质酶上，从而提高角质酶对棉纤维的结合效率及精练效果（吴敬, 陈坚, 张瑶, 陈晟. 一种耐热角质酶-CBD的制备及其在棉纤维精练中 的应用. 申请号 200910033667.0）。为了使角质酶-CBD能有效地作用于涤纶纤维，通过对CBM进行结构模拟，结合涤纶纤维结构特点，利用定点突变方法提高角质酶-CBD对涤纶纤维的改性效果。这种提高酶催化效率的结合位点改造策略目前国内外未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种耐热角质酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种耐热角质酶-CBD融合酶的突变体，包括一个相应于嗜热子囊菌（Thermobifida fusca）的角质酶-CBD结合位点的氨基酸残基的取代，突变成与涤纶聚酯结构类似的氨基酸，与角质酶-CBD融合酶相比具有更强的涤纶纤维水解效率。

所述角质酶-CBD突变体是在CBD上的第68位色氨酸Trp突变为亮氨酸Leu，命名为W68L；突变为酪氨酸Tyr，命名为W68Y。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述突变体的制备方法。

为解决上述问题，本发明的技术方案是：其特征是在纤维素结合域模拟结构的基础上确定突变位点；设计定点突变引物，以携带角质酶-CBD基因的pET20b（+）载体为模板构建突变质粒W68L-pET20b和W68Y-pET20b；将突变质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性克隆进行发酵培养，30℃培养48 h；发酵上清液经硫酸铵沉淀、亲和色谱纯化角质酶-CBD突变体W68L和W68Y。

所述耐热角质酶-CBD融合酶及其突变体应用于涤纶纤维改性亦为本发明要求保护的范围。

本发明提供了一种耐热角质酶-CBD融合酶及两种具有涤纶纤维高水解效率的耐热角质酶-CBD突变体及其制备方法；突变体W68L和W68Y对涤纶纤维的吸附效率比角质酶-CBD分别提高14%和17%，而对涤纶纤维的水解效率分别是天然角质酶-CBD的1.4倍和1.5倍，非常适宜涤纶纤维改性中应用。

附图说明

图１耐热角质酶-CBD突变体分离纯化SDS-PAGE图谱

1, W68L发酵上清液; 2, W68Y发酵上清液; 3, W68L Ni柱纯化结果; 4, W68Y Ni柱纯化结果

图2耐热角质酶-CBD突变体50℃稳定性研究

图3耐热角质酶-CBD突变体对涤纶水解效率分析。

具体实施方式

实施例1 角质酶-CBD融合酶的制备方法