[发明专利]铁皮石斛的组培繁殖方法

说明书

所属技术领域：

本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种铁皮石斛的无激素组织培养快繁方法。

背景技术：

铁皮石斛(Dendrobium officinale)，别名黑节草，是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)中名贵的药用植物，是中华九大仙草之首，有极其丰富的药用价值，野生资源极少，主要分布于云南、广西、安徽等地。据《本草纲目》记载，铁皮石斛具有“主治伤中、补五脏虚劳、强阴益精、厚肠胃、补内绝不足、平胃气、长肌肉、益智除惊、轻身延年之功效”。由于其茎干入药，对咽喉疾病、提高人体免疫力乃至肿瘤都具有显著疗效，成为了驰名中外的保健佳品。由于人们长期的野外采挖，野生的铁皮石斛已经到了濒危的状况。铁皮石斛坐果率很低，种子不易发芽，自然繁殖率极低。建立组培快繁体系可以从根本上解决这一问题。

迄今，铁皮石斛组培快繁立法大多都选用茎尖、新芽、休眠芽为外植体，通过拟原球茎途径培养。用无菌种子产生原球茎组培方法鲜有报道。尽管这些方法优化了传统生产的培养基成分，操作简便，生产成本低，药用成分接近野生铁皮石斛，但存在繁殖率较低，分化慢，难于进行批量生产和工厂化生产等问题。

发明目的：

针对现有技术存在的上述不足，本发明旨在提供一种铁皮石斛的无激素组织快繁方法，各阶段采用不同的优化培养基配方，使之在野生种源缺乏及繁殖率低的情况下能够快速繁衍，使该物种的优良性状的保存能够得到保障，同时避免了通过拟原球茎途径造成的周期长的缺点，缩短离体培养时间及生产成本，提高生根率和幼苗移栽率，为铁皮石斛的可持续利用奠定组培种苗繁育基础。

本发明的上述目的是用下述的技术方案加以实现的：

铁皮石斛的无激素组培繁殖方法，包括蒴果消毒、原球茎诱导，分化并壮苗生根培养，试管苗移栽步骤，取铁皮石斛的成熟蒴果进行原球茎诱导、分化、壮苗、生根培养，培养的温度为20-23℃，湿度为30-45％，光照条件为自然光2000-2500LUX+人工辅助光1500-2000LUX，光照时间为12h/d；所述的原球茎诱导培养基为改良MS+10％香蕉+10％马铃薯+蛋白胨1％，分化培养基为B₅+10％香蕉+10％马铃薯，壮苗生根培养基为1/2改良MS+20％香蕉+活性炭0.5％；改良MS用KNO₃减半，NH₄NO₃减半。

所述的组培繁殖方法中，蒴果消毒先用5％洗衣粉水浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫，然后采用75％的酒精灭菌3min，无菌水冲洗3遍后再用0.1％升汞溶液进行表面消毒10min-15min，分两次进行，第一次消毒5-8min，不断震荡后用无菌水清洗3-5遍，再用0.1％升汞消毒5-7min后用无菌水清洗3-5遍。

所述的组培繁殖方法，移栽是生根组培苗在培养瓶内培养45天以后炼苗30天，再移栽于温室大棚。

所述的组培繁殖方法，移栽基质为白水苔或锯末、松树皮，pH为5.8。

所述的组培繁殖方法，移栽在早上8-11点，温度18-25℃下进行。

具体地，本发明的组培繁殖方法为：选取铁皮石斛成熟的蒴果，先用5％洗衣粉水浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫，然后采用75％的酒精灭菌3min，无菌水冲洗3遍后再用0.1％升汞溶液进行表面消毒10min-15min，分两次进行，第一次消毒5-8min，不断震荡后用无菌水清洗3-5遍，再用0.1％升汞消毒5-7min后用无菌水清洗3-5遍。将蒴果置于消毒后的滤纸上，切去两端后纵切，将种子撒播于原球茎诱导培养基即改良MS+10％香蕉+10％马铃薯+蛋白胨1％中，pH为5.8，改良MS用KNO₃减半，NH₄NO₃减半，1.5个月后将长出的原球茎放入分化培养基即B₅+10％香蕉+10％马铃薯中进行苗分化，1.5个月后将形成的小苗放入壮苗及生根培养基即1/2改良1/2改良MS+20％香蕉+活性炭0.5％中，瓶内培养45天生根后进行组培苗炼苗30天，移栽于白水苔或锯末、松树皮、湿度40％-50％、pH为5.8的基质苗床上，空气湿度为60％-80％，每天早晚各喷水一次。

与现有技术相比，本发明的组培方法的优点在于：