[发明专利]力生长因子在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程重组技术领域，涉及一种新型生长因子在改良工程细胞方面的应用，特别涉及力生长因子（Mechano growth factor, MGF）在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用。

背景技术

在生物技术领域，基因工程重组技术无疑是最具革命性的技术，该技术使人类可以对物种进行改造，通过基因重组构建工程菌、哺乳动物工程细胞、转基因动植物等，从而获得所需的生物制品或更具经济价值的生物品种。长期以来，重组蛋白的生产多采用大肠杆菌表达系统，但有许多重要蛋白在大肠杆菌中无法进行有活性的表达，对大肠杆菌进一步的遗传改造也收效甚微。与大肠杆菌相比，用哺乳动物细胞表达重组蛋白具有独特的优势：哺乳动物细胞能够正确有效地识别蛋白的合成、加工和分泌信号，能够准确地完成糖基化、磷酸化，形成链内和链间二硫键以及蛋白水解等翻译后加工过程，所表达的蛋白具有天然蛋白一样的生物活性。但与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞的工程化培养面临诸多困难，主要原因在于：哺乳动物细胞对培养基的要求高，对大规模发酵环境下的应激环境非常敏感，容易发生细胞死亡或凋亡。虽然通过优化培养基配方和培养条件获得了一些有利成果，但一些问题仍然无法从根本上得到解决。近年来，随着对细胞代谢途径和调控机理的深入研究，越来越多的研究者将研究方向转向对细胞本身进行改造，通过基因工程重组技术使细胞对体外培养的适应能力更强，从而满足产业化大规模培养的要求。

在哺乳动物细胞发酵工程中，为了下游纯化方便和提高生物安全性，也为了降低生产成本，通常需要进行无血清培养，但血清中所含的各种生长因子、细胞因子、激素、粘附蛋白等成份往往是细胞存活和增殖所必须的。因此，提高哺乳动物工程细胞对无血清培养的耐受力，是哺乳动物细胞发酵工程的关键。

MGF是胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的一种变体，由Igf-1基因剪接变异产生。与IGF-1相比，人MGF多出长40个氨基酸的羧基端短肽序列（啮齿类动物为41个氨基酸，两种MGF的功能相同），该短肽可以作用于独立的受体；并由于来自外显子5的49bp（啮齿类动物为52bp）的插入序列，导致外显子6的翻译发生移码突变，产生特异的长24个氨基酸的羧基端E肽序列（啮齿类动物为25个氨基酸），该序列可以作为MGF的活性片段单独发挥MGF的生物学功能。MGF最初是在机械损伤的骨骼肌中被发现的，目前发现心肌、成骨细胞、子宫内膜细胞、肌腱成纤维细胞等在损伤状态下都有MGF的表达。既往研究显示，MGF具有保护损伤细胞、促进损伤修复的功能，预示了该因子在医学上的应用前景。但MGF能否应用于细胞工程领域以提高哺乳动物工程细胞对大规模发酵环境下无血清培养的耐受力，目前尚未见国内外文献报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于研究MGF能否应用于细胞工程领域以提高哺乳动物工程细胞对大规模发酵环境下无血清培养的耐受力，进而获得一种更适合生物制品工业化大规模生产的哺乳动物工程细胞。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

MGF在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用。

所述MGF可以来源于啮齿类动物鼠，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因序列如SEQ ID No.4所示。鉴于除鼠外的其它啮齿类动物来源的MGF、人源MGF与鼠源MGF都具有高度类似的序列和相同的功能，并都能在不同种属的细胞中得到表达，因此，所述MGF也可以来源于除鼠外的其它啮齿类动物，如兔，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码基因序列如SEQ ID No.5所示；还可以来源于人，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码基因序列如SEQ ID No.6所示。

所述哺乳动物工程细胞的宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）、幼仓鼠肾细胞（BHK）和人胚肾293细胞等。

本发明的有益效果在于：本发明提供了MGF在制备无血清培养耐受型哺乳动物工程细胞中的应用，通过将MGF编码基因转入哺乳动物细胞，可以构建出能稳定、自主表达MGF的工程细胞，该工程细胞通过表达MGF能显著提高对无血清培养的耐受能力，可降低对发酵条件的要求，减少培养成本，特别适用于生物制品的工业化大规模生产，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为携带MGF编码基因的重组慢病毒质粒构建示意图。