[发明专利]一种从鸭肌肉中分离磷脂绑定蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于农产品加工技术领域，涉及一种从鸭肌肉中分离磷脂绑定蛋白的方法。

背景技术

磷脂绑定蛋白具有很强的结合磷脂能力，结合产物能抑制磷脂酶活性、减弱氧自由基对磷脂的攻击，因此磷脂绑定蛋白具有保护磷脂、防止磷脂氧化的作用，在医药、食品、生化等领域具有广泛的应用前景。

到目前为止，有关磷脂绑定蛋白的提取纯化方法研究较少，不能满足对磷脂绑定蛋白纯品的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种从鸭肌肉中可大量获取磷脂绑定蛋白的方法。

本发明方法步骤是：

1）取鸭肌肉组织剁碎后加入Tris-HCl缓冲液中匀浆，将浆液静置1小时；

2）将浆液离心，取上清液，在上清液中加入75%饱和度的硫酸铵进行盐析，然后离心，将沉淀物用Tris-HCl缓冲液溶解，取得混合溶液；

3）将混合溶液置于透析袋中，在Tris-HCl缓冲液中进行去盐透析，取得去盐的透析物；

4）将去盐的透析物离心去除变性蛋白，取得磷脂绑定蛋白粗品；

5）将磷脂绑定蛋白粗品纯化后，得磷脂绑定蛋白纯品；

其特点是：在所述步骤5）中的所述方法是：采用source 15Q、10cm×1.0cm的离子交换柱，用pH为7.5、浓度为50mmol/L、流速为0.2mL/min 的Tris-HCl缓冲液平衡，待紫外吸收和电导基线稳定后，再用pH为7.5、含1.5mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液进行线性洗脱，控制NaCl的Tris-HCl缓冲液进入离子交换柱的流速为1.5mL/min，开始收集滤出液，当滤出液的NaCl浓度达到100%时停止收集；将收集的滤出液进行超滤浓缩，取得磷脂绑定蛋白纯品。

本发明首先进行粗蛋白提取，然后使用离子交换柱对磷脂绑定蛋白进行纯化。本发明可以满足对磷脂绑定蛋白纯品的需要，其对动物源磷脂（如肌内磷脂、蛋黄卵磷脂等）的有较好的保护作用。因此本发明在医药、食品、生化等领域具有广泛的应用前景。

本发明采用离子交换法从鸭肌肉中分离磷脂绑定蛋白，其优点在于：

（1）分离方法快速简洁，蛋白纯化只需经过离子交换柱即可完成。

（2）对磷脂的绑定能力很强，每克磷脂绑定蛋白可结合14.89克磷脂，结合产物能抵抗磷脂酶的水解作用。

附图说明

图1为磷脂绑定蛋白的离子色谱图。

图2 为本发明所得磷脂绑定蛋白的电泳图。

图3 为本发明所得磷脂绑定蛋白的与磷脂结合前微乳溶液的液相色谱图。

图4为本发明所得磷脂绑定蛋白的与磷脂结合后磷脂微乳溶液的液相色谱图。

具体实施方式

一、提取具体步骤：

（1）取鸭股二头肌，剔除可见的结缔组织和脂肪组织后剁碎，称取35g，在4℃环境温度下，加入100mL 、pH值为7.5、浓度为0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，在搅拌速度为15000rpm/min的条件下匀浆30秒，形成浆液并静置1小时。

（2）在4℃环境温度下，将浆液离心15min（离心机转速12000rpm/min），取上清液，用五层纱布过滤，然后加入75%饱和度的硫酸铵进行盐析。

在4℃环境温度下，取盐析后产品离心15min（离心机转速12000rpm/min），取沉淀物用4mL 、pH值为7.5、浓度为0.2mol/L的 Tris-HCl缓冲液溶解，取得混合溶液。

（3）将混合溶液置于MWCO=20K Da的透析袋中，在4℃环境温度下，以pH为7.5、浓度为0.2 mol/L的Tris-HCl缓冲液进行透析去盐12h，取得去盐的透析物。

（4）在4℃环境温度下，将去盐的透析物离心10min（离心机转速10000rpm/min），去除变性蛋白，取得磷脂绑定蛋白粗品。

（5）每次取磷脂绑定蛋白粗品1.0mL用蛋白纯化系统纯化，具体操作如下：

取source 15Q、10cm×1.0cm的离子交换柱，用pH为7.5、浓度为50mmol/L、流速为0.2mL/min 的Tris-HCl缓冲液平衡，待紫外吸收和电导基线稳定后，再用pH为7.5、含1.5mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液进行线性洗脱，控制NaCl的Tris-HCl缓冲液进入离子交换柱的流速为1.5mL/min，开始收集滤出液，当滤出液的NaCl浓度达到100%时停止收集。

将收集的滤出液进行超滤浓缩（MWCO=20KDa），即为磷脂绑定蛋白纯品。

二、鉴定分析