[发明专利]一种抗三聚氰胺单链抗体及其应用体

说明书

技术领域

本发明涉及噬菌体展示技术和基因工程抗体技术，特别是涉及一种抗三聚氰胺单链抗体；本发明还涉及该抗体在检测三聚氰胺样品中的应用。 

背景技术

三聚氰胺（melamine）简称三胺，由德国化学家Justusvon Liebig于1834年首次合成，学名三氨三嗪。三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，它主要用于生产三聚氰胺—甲醛树脂，同时广泛用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。比如，现代工艺多采用尿素合成的三聚氰胺树脂常常被用于生产制作食品包装或餐具，因此通过用三聚氰胺树脂为原材料的食品包装或餐具会将三聚氰胺迁移至食品中。杀虫剂灭蝇胺的代谢产物三聚氰胺沿食物链富集进入植物或动物源食物也会导致食品中污染三聚氰胺。慢性高剂量摄入三聚氰胺会诱发肾脏病理学，引起动物肾脏功能衰竭甚至导致死亡。由于三聚氰胺与蛋白质相比含有更多的氮原子，所以添加在食品中的三聚氰胺可以造成食品蛋白质含量较高的假象，因而常被不法商贩所利用。三聚氰胺被投机者用作食品添加剂，给人类生活带来了很大的安全隐患，因此迫切需要快速、准确、有效的检测方法来监测食物中的三聚氰胺残留。

免疫学检测方法具有操作简便、快速、检测成本低、通量高、对技术人员的要求低的优点，适合于三聚氰胺的现场检测。采用ELISA方法检测三聚氰胺，需要抗三聚氰胺的抗体。以抗原免疫动物获得多抗血清是制备抗体的经典方法，但制备周期长，得到的抗体量有限。B淋巴细胞杂交瘤技术获得单克隆抗体，其特异性强，性质均一，但不易于大批量发酵生产。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性抗体，使单克隆抗体的研制有了重要进展。已有研究报道，重组单链抗体（scFv）能够保留与亲本单克隆抗体（mcAb）结构相一致的抗原识别位点。噬菌体抗体库技术的产生为筛选获得高灵敏性重组抗体提供了简便而高效的操作系统。将筛选得到的重组抗体基因导入表达宿主中，能实现特异性抗体的大量生产。

  

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种重组单链抗体序列，该抗体能特异性结合三聚氰胺，可被用于检测食品、水产品、饲料等样品中三聚氰胺的含量。

本发明的第二个目的在于提供编码上述单链抗体的基因。

本发明的第三个目的在于提供上述抗体在制备三聚氰胺检测试剂中的应用。

本发明提供的一种抗三聚氰胺单链抗体，其轻链可变区的氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了编码上述抗体的基因。编码轻链可变区的核苷酸序列和编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了一种将上述的抗体经过改造得到的衍生抗体，所述改造包括氨基酸的缺失、替换或插入，并且不改变抗体的活性。

    含有本发明所述基因的表达载体及表达载体的宿主均属于本发明的保护范围。

一种与SEQ ID No.1 具有至少90% 同源性且编码相同功能蛋白质的序列，以及一种与SEQ ID No.2 具有至少90% 同源性且编码相同功能蛋白质的序列，也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了上述抗体在检测三聚氰胺中的应用。

本发明应用噬菌体表面展示技术，通过抗体基因工程技术构建了兔源抗三聚氰胺抗体文库，并筛选获得特异抗三聚氰胺抗体scFv片段，获得的scFv片段命名为B4-scFv。

B4-scFv特异性的轻链和重链可变区基因来源于对兔源抗三聚氰胺单链抗体文库的特异性富集筛选，该抗体库的建立来源于日本大耳兔的脾脏细胞基因。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的抗原决定簇互补区域CDRs中特异性核苷酸序列决定，6个相应的CDRs区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定发明中抗体的抗原结合特征（表1）。

表1 B4-scFv抗体的轻链和重链高可变区序列

B4-scFv轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。编码B4-scFv轻链可变区的基因序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID No.4所示。

将上述编码scFv基因克隆到表达载体中，进而转化宿主Rosseta中，通过诱导表达获得scFv抗体。利用SDS-PAGE和ELISA对获得的B4-scFv抗体进行功能鉴定，结果表明B4-scFv对三聚氰胺有特异性结合，并且能灵敏的检测出牛奶样品中三聚氰胺。