[发明专利]一种新型脑肠肽激动剂分子的制备方法及其应用

说明书

技术领域

一种新型脑肠肽激动剂分子制备方法及其应用，属于蛋白质药物技术领域。

背景技术

在人体内，有些肽类在胃肠和神经系统双重分布，称为脑肠肽(braingutpeptide)。脑肠肽不仅在外周广泛地调节着胃肠道的各种功能，而且在中枢也参与对胃肠道生理活动的调节。

脑肠肽类蛋白质可作为药物用于治疗多种疾病，如糖尿病等。药代动力学研究表明，多肽/蛋白类药物主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除，其中分子量小于20kDa的多肽因子在代谢过程中易被肾小球滤过，通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分降解并从尿中排出，因而多肽因子的半衰期短。为了达到治疗效果，需要频繁的大剂量用药，长期的频繁注射不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且易引发一系列严重的毒副作用。因此寻找新型长效的蛋白质/肽分子一直是药物邻域研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型脑肠肽激动剂分子，其核苷酸序列如附图1所示，简称GGH。

本发明的目的还在于提供一种GGH的制备方法。

本发明的目的还在于提供一种毕赤酵母高产菌株KM71(pPIC9K-GGH)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.4892，保藏日期为2011年5月24日。

本发明的目的还在于提供一种毕赤酵母高产菌株KM71(pPIC9K-GGH)的制备方法。

为了实现上述目的，本申请人做了如下工作。用生物信息学软件InsightII、ICMpro、Amber计算得出新型脑肠肽激动剂分子的合理构象，并完成了其与脑肠肽的分子对接，进一步利用PCR技术扩增了新型脑肠肽激动剂分子基因。首先利用DNA合成仪合成了将GLP-1的N末端第二位的丙氨酸突变为甘氨酸的核苷酸序列(GLP-1_A2G)₂，然后选择(GLP-1_A2G)₂作为目标分子与人白蛋白融合表达，即采用蛋白质融合技术。利用白蛋白分子质量大的性状将药物的易致机体产生过敏的部分包裹，使药物蛋白的活性部分暴露。利用重叠PCR技术，在体外成功拼接(GLP-1_A2G)₂基因和HSA基因，得到融合基因(GLP-1_A2G)₂-HSA，简称GGH。

由于大肠杆菌表达系统的不足，本申请人还构建了毕赤酵母高产菌株KM71(pPIC9K-GGH)，使GGH可以高效表达，并实现产业上的应用。本申请人将GGH与毕赤酵母的分泌型多拷贝质粒pPIC9K连接，线性化之后通过电转到毕赤酵母KM71中，通过G418筛选，经G418抗性筛选得到能耐受3mg/mL G418重组菌12株，耐受4mg/mLG418重组菌5株，进行甲醇诱导表达，筛选得到1株表达量高的重组菌KM71(pPIC9K-GGH)，表达量为162mg/L。

此外，申请人将获得的GGH进行了一系列的小鼠实验显示了该目标蛋白的具有良好的生物活性和较长的半衰期。GGH在体外对胰岛原代细胞有较好的刺激作用，在浓度45nmoL时增殖率为35.4％，与单体的GLP-1相差不大。在糖耐量实验中，GGH可以较好的控制小鼠的血糖水平，并且在给药72h后中、高剂量组仍然有生物活性，而单体的GLP-1在给药4h后就检测不到生物活性。

附图说明

附图1GGH融合基因序列

附图2在含4mg/mLG418的MD平板上长出的菌落表达情况

附图3PCR验证pPIC9K-GGH的KM71阳性转化子

附图4GGH的Western blot鉴定

附图5GGH对胰岛细胞的增殖作用

附图6不同时间小鼠的血糖增量

附图7GGH与其他类似物药效比较

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

实施例1重组表达质粒pPIC9K-GGH的构建

本实施例中所使用的培养基配方如下：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10mmol/L，pH 7.0。需要时使用前加入100μg/mL氨苄青霉素，固体培养基添加15g/L琼脂，用于大肠杆菌培养。