[发明专利]一种筛选抗血管生成活性物质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选抗血管生成药物的方法，特别是一种利用斑马鱼模型筛选抗血管生成药物的方法，属于药物筛选领域。

背景技术

血管生成是恶性肿瘤发生发展过程中的必要过程，与恶性肿瘤的生长和转移有十分密切的关系。肿瘤血管对于恶性肿瘤的作用主要表现在两方面，1、肿瘤血管为肿瘤细胞的生长提供必需的养料和氧；2、肿瘤血管的存在为肿瘤细胞侵入循环系统、进而实现远处器官转移提供了前提。1971年Folkman首先提出肿瘤生长和转移是血管依赖性的，阻断血管生成是遏制肿瘤生长的有效策略这一著名学说，使人们开始认识到血管对于肿瘤的重要意义。

抗血管生成已经成为有效治疗肿瘤的策略之一。建立可靠的血管生成模型是血管生成研究方面的基础。

动物模型是现代生物医学和药理学研究中的一个极为重要的实验方法和手段。人们可通过不同手段复制出各种模型，在人为设计的实验条件下反复观察和研究，避免了人体实验造成的伤害。模型动物不仅在群体数量上容易得到满足，而且可以在方法学上严格控制实验条件，增强实验材料的可比性。斑马鱼模型是一种理想的抗血管生成药物筛选体内模型。其胚胎早期发育的过程中，血管生成的模式比较简单，主要出现在头部和躯干部体节间，体节间的血管最初由背部的动脉出芽形成于相邻体节之间。现有的利用斑马鱼检测样品抑制血管生成活性的方法主要有两种。1)碱性磷酸酶染色方法。Parng等利用此模型筛选活性成分，在96孔板上用待测样品处理胚胎，通过血管内源性碱性磷酸酶染色来显示血管，进而评价待测样品对血管生成的作用。该方法操作繁琐，而且不能实时观测血管生成情况。2)荧光标记血管法。Cross等研究发现荧光标记血管的转基因斑马鱼(VEGFR2：GFP)可用来快速筛选抗血管生成药物，认为其有潜力成为一种高通量筛选模型。一些抗血管生成药物如SU5416、SU6668、TNP470作用于斑马鱼的效果与在哺乳动物中的相近。该方法简便快捷，但是靶点单一，只有影响VEGFR2(II型血管内皮生长因子受体)表达的样品才能出现阳性结果，而且影响VEGFR2表达的样品，不一定影响血管生成。上述实例证实了利用斑马鱼筛选抗血管生成药物的有效性，但是上述模型存在的不足之处极大地限制了抗血管生成活性物质的筛选。本领域迫切需要开发既操作便捷又能综合反映样品抑制血管生成活性的筛选抗血管生成活性物质的方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用斑马鱼模型中生成有血流的血管数量来筛选抗血管生成药物的方法，以获得具有药物开发价值的新的活性物质。

一种筛选抗血管生成药物的方法，步骤如下：

(1)将发育20-28小时的辐鳍鱼纲动物胚胎放入由对血管生成有抑制作用的待筛选物质配制的溶液中，培养20-28小时后，观测辐鳍鱼纲动物胚胎的循环系统发育情况，在心脏形态正常和心率正常的前提下，统计辐鳍鱼纲动物胚胎体节间有血流的血管数量，得实验组节间血流数；

(2)观测培养20-28小时后的对照组辐鳍鱼纲动物胚胎的循环系统发育情况，在心脏形态和心率正常的前提下，统计辐鳍鱼纲动物胚胎体节间有血流的血管数量，得对照组节间血流数；

(3)将步骤(1)获得的实验组节间血流数与步骤(2)获得的对照组节间血流数按如下公式计算：

得到血管生成抑制率，当血管生成抑制率大于30％时，待筛选物质即为对血管生成有抑制作用的抗血管生成活性物质。

所述步骤(1)中，辐鳍鱼纲动物为斑马鱼。

上述斑马鱼为野生型斑马鱼。

所述步骤(1)中，对血管生成有抑制作用的待筛选物质为天然活性物质或化学合成物质。

上述天然活性物质为来自植物、动物和/或微生物中的由单一组分或者多种组分构成的物质。

上述多种组分的数量为2-50种；优选的，上述多种组分的数量为2-25种；更优选的，上述多种组分的数量为2-15种。

所述步骤(2)中，对照组辐鳍鱼纲动物胚胎为：施用了阴性/阳性对照药物的阴性/阳性辐鳍鱼纲动物胚胎、正常培养的辐鳍鱼纲动物胚胎或施用了相应浓度溶剂的辐鳍鱼纲动物胚胎。