[发明专利]鉴定北京基因型结核分枝杆菌的分子标识和方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定结核分枝杆菌的分子标识和方法，尤其涉及一种鉴定北京基因型结核分枝杆菌的分子标识和方法。

背景技术

世界卫生组织报告指出，结核分枝杆菌引起的结核病是世界上感染率最高的感染性疾病，同时也是全球各种传染病中引起最多死亡的疾病，据估计，全球人口中的三分之一感染结核分枝杆菌。其中，北京基因型结核分枝杆菌（M．tb Beijing genotype，又称北京株，Beijing Strain）最早发现于中国、蒙古、俄罗斯等地，是结核分枝杆菌中的重要家族，传播疾病快、耐药性强，而且北京基因型结核分枝杆菌在吞噬细胞或单核球内，具有更好的生长能力，该家族病毒成员导致了较高的耐药率和死亡率，世界范围内多个地区耐药率的增长与该家族有关。

据台湾卫生署调查研究，在较年轻的结核病感染人群中，北京株感染比例较高，小于24岁的结核病患者，北京株感染所占比例高达61.5%。据西班牙Gran Canaria Island的研究，北京株感染人数成逐年增加的趋势。

总之，北京株在世界各国有逐渐蔓延的趋势。北京株致病比例与男女性別统计学上的显著性，北京株在30岁以下青少年比例较高，而且北京株较其它结核分枝杆菌具有较高的致病性，传播率以及耐药性；加之结核病具有潜伏感染的特点，因此，对北京基因型结核分枝杆菌的鉴定对于结核的预防非常重要。

间隔区寡核苷酸分型法（spoligotyping）是鉴定北京基因型结核分枝杆菌的金标准，由于这种方法过于复杂和繁琐，存在花费时间长、价格昂贵等缺点，许多研究者都致力于找出快速低廉的替代方法。

PCR方法已经被广泛的应用于结核分枝杆菌的鉴定，寻找分子标识是PCR方法的关键所在，目前常用的鉴定北京基因型结核分枝杆菌的分子标识主要包括：1）具有类似IS6110类型（15~20拷贝）；2）均属于主遗传群1；3）基因组DNA A~DNA N 位点有一个IS6110 插入；4）具有相同的特征性间隔寡型（S00034）；5）耐异胭肼相关的kat G 基因315 位密码子的双核苷酸改变（AGC→ACA）；6）RD105区缺失。

发明内容

本发明提供了一种新的鉴定北京基因型结核分枝杆菌的分子标识，以及利用所述分子标识鉴定北京基因型结核分枝杆菌的方法；所述分子标识为位于结核分枝杆菌Rv0050编码基因中的CCG简单串联重复序列，为鉴定北京基因型结核分枝杆菌提供了一种新的途径和方法。

本发明第一个目的是提供一种用于鉴定北京基因型结核分枝杆菌的分子标识，所述分子标识为寡核苷酸串联重复序列(CCG)₄CCT(CCG)₄TCG，具体为CCGCCGCCGCCGCCTCCGCCGCCGCCGTCG。

所述序列中，含有10个重复单元，从左到右，第5个重复单元发生改变（CCG→CCT），第十个重复单元发生改变（CCG →TCG），其余八个重复单元为CCG。

本发明第二个目的是提供一种鉴定北京基因型结核分枝杆菌的方法，步骤包括：

步骤1，以含有微卫星CCG位点的Rv0050基因序列为模板，设计一对同源引物；

步骤2，提取待测样品DNA为模板DNA，利用步骤1中设计的一对同源引物进行PCR扩增；

步骤3，将PCR产物克隆测序获得PCR扩增片段的核酸序列，如果扩增片段中有的CCG简单串联重复序列形态是(CCG)₄CCT(CCG)₄TCG，则判定为北京基因型结核分枝杆菌，如果扩增片段中有的CCG简单串联重复序列形态不是(CCG)₄ CCT(CCG)₄TCG，则不是北京基因型结核分枝杆菌。

其中，所述一对同源引物优选为：

5'-TTGAAGGGCACGTCGAACGAG-3'；

5'-GGGACCGATCGGGATGGTAA-3'。

本发明第三个目的是提供另一种鉴定北京基因型结核分枝杆菌的方法，步骤包括：

步骤1，以含有微卫星CCG位点的Rv0050基因序列为模板，设计一对同源引物；

步骤2，提取待测样品DNA为模板DNA，利用步骤1中设计的一对同源引物进行PCR扩增，