[发明专利]一种大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法

说明书

技术领域

一种大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，属于生物学技术领域。

背景技术

大肠埃希杆菌O157∶H7广泛存在于自然界中，是一种重要的人畜共患病致病菌，人被感染后常引起严重腹泻和败血症，严重的可引起溶血性尿毒综合征(HUS)、血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP)，其中并发HUS和TTP者死亡率高达80%左右，因此，如何控制大肠埃希杆菌O157∶H7的感染是目前公共卫生学中的重要课题，对大肠埃希杆菌O157∶H7的快速、准确检验是保证人类健康的必要手段。

传统的检测细菌的方法包括了生化培养、分离鉴定，检验程序复杂繁琐，报告检验结果大致需4～7d，耗时太长，而且检测灵敏度低。

随着分子生物学的发展，PCR技术已广泛应用于食品微生物、动植物疫病、饲料成分及转基因成分的检测领域，使食源性致病菌的快速检验发展到一个崭新的高度。本发明提供一种大肠埃希杆菌O157∶H7 PCR检测中阳性标准物质的制备方法，使PCR的检测结果更加确凿。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取纯化大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，以便使PCR样品的检测结果更加准确。

本发明的技术方案：一种提取纯化大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA作为PCR标准物质的制备方法，利用羧基化的磁性纳米粒子提取了大肠埃希杆菌O157:H7基因组DNA；大肠埃希杆菌O157∶H7已为下列文献公开，文献1：[Food Microbiology 23 (2006) 162–168.The use of Fourier transform infrared spectroscopy to differentiate Escherichia coli O157:H7 from other bacteria inoculated into apple juice；Murad A. Al-Holy^a, Mengshi Lin^b, Anna G. Cavinato^c, Barbara A. Rasco^b]；

文献2：[Food Research International 39 (2006) 98–105.Inactivation of food spoilage bacteria and Escherichia coli O157:H7 in phosphate buffer and orange juice using dynamic high pressure；Imane Tahiri, Joseph Makhlouf *, Paul Paquin, Ismail Fliss].

(1) 大肠埃希杆菌O157∶H7的培养：

按传统培养方法对大肠埃希杆菌O157∶H7进行增菌培养；

(2) 表面羧基化的磁性纳米粒子的制备：

制备羧基修饰的磁性纳米粒子，用于吸附大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA；

(3) 病原微生物大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA的提取；

(4) 用步骤(2)得到的大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA过Sephadex G-200分离柱进行分离纯化；

(5) 用步骤(4)得到的纯化后的大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA测定ICP-MS计算浓度；

（6）将步骤(4)纯化后的DNA的PCR扩增产物进行PCR检测，琼脂糖电泳检测大肠埃希杆菌O157∶H7的目的条带。

各步骤的操作详见具体实施例。

本发明的有益效果：本发明采用羧基化的磁性纳米粒子提取了大肠埃希杆菌O157:H7基因组DNA，并进行分离纯化，电感耦合等离子体质谱ICP-MS测定P元素以确定提取DNA浓度，最终进行PCR扩增，电泳检测目的条带明显，-20℃保存半年性质不变，稳定性高，可以作为大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA的PCR标准物质，以便使PCR样品的检测结果更加准确。

附图说明

图1：Sephadex G-200分离纯化图。

图2：基因组DNA样品琼脂糖凝胶电泳图。

图3：基因组DNA样品-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1．大肠埃希杆菌O157∶H7基因组DNA进行粗提；