[发明专利]一种中华鳖虹彩病毒的超分支滚环扩增检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及中华鳖虹彩病毒的检测方法，尤其是涉及一种中华鳖虹彩病毒的超分支滚环扩增检测方法。

背景技术

中华鳖是一种珍贵的水生爬行动物，肉味鲜美，营养丰富，具有重要的研究价值。随着人民生活水平的提高，市场需求量有所增加，中华鳖人工养殖业蓬勃发展。由于中华鳖的高密度集约化养殖方式，加上中华鳖商品和种苗交易频繁，各种疾病频繁发生，鳖病已经严重威胁着我国养鳖业，年经济损失达数亿元，制约了养鳖业的进一步发展。因此，疾病防治是中华鳖养殖业的重要研究方向。引起中华鳖传染性病害的病原体主要有细菌、真菌、寄生虫、病毒等，而且经常是几种病原混合感染。针对前三种病原，养殖者已经有一套比较成熟的预防和治疗方法。然而，病毒病的研究还处在起步阶段。关于中华鳖病毒病的研究报导甚少。近年来，由病毒引起的甲鱼疾病呈明显上升趋势，给中华鳖养殖业造成重大的经济损失。到目前为止，在我国发现的中华鳖病毒有7种，即弹状病毒、类呼肠孤病毒、类腺病毒、类似核糖核酸病毒的中华鳖病毒、类似嵌杯样病毒的中华鳖球状病毒、中华鳖虹彩病毒，陈在贤等从中华鳖的体内分离到一株直径为120-160nm的虹彩病毒(Soft-she1led turtle iridovirus，STIV)。病害的防控迫切需要建立快速、特异、准确的诊断技术。

现行的中华鳖虹彩病毒(Soft-shelled turtle iridovirus，STIV)的检测方法主要有血清学检测和胶体金免疫检测等常规诊断方法，这些方法操作繁复、检测周期长、检测灵敏度低；基于靶标DNA扩增的PCR技术作为成熟的分子检测方法，已用于该病毒的检测鉴定(范万红等2007)，但常规的PCR技术是对检测靶标的扩增，增加了交叉感染的风险，以及灵敏度偏低，无法及时准确地检测病害；而且上述检测方法往往需要特定的设备、实验室及分子生物学专业实验人员操作，在实际现场操作时会有较大的局限性。

超分支滚环扩增法(hyperbranched rolling circle amplification，HRCA)因其高特异性、高灵敏度、快速简便等优点越来越多的应用于分子生物学基础研究和实际检测中。该技术能在短时间内(1h)进行大量扩增，扩增倍数达到10⁷(Thomas et al.1999)，灵敏度极高，能够检测到单分子水平(Zhang et al.2001)。HRCA技术安全、快捷、高效、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术所无法替代的优势，HRCA技术已成为研究热点，广泛运用于医药、畜牧与兽医，农林等领域。但很少见到HRCA在水产动物病原检测方面的报道，本发明第一次将HRCA技术应用于STIV的检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于超分支滚环扩增技术检测中华鳖虹彩病毒的方法，以实现对中华鳖虹彩病毒进行快速、特异、简便的现场检测。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种中华鳖虹彩病毒的超分支滚环扩增检测方法，包括以下步骤：

(1)锁式探针的合成：从基因库中选取一段中华鳖虹彩病毒独有的主衣壳蛋白MCP(major capsid protein)(登录号为EU627010)基因序列，从MCP基因序列中分别选取20个碱基作为锁式探针5′端和3′端的特异识别区，5′末端碱基和3′末端碱基在MCP基因序列上连续，从质粒载体pNAK1中选取一段序列，将该序列中与5′末端碱基和3′末端碱基互补的碱基替换后形成的核苷酸序列作为锁式探针的连接段部分，然后进行锁式探针的合成，所述的锁式探针的核苷酸序列如下：

5’-CTGCGTCACTCCCGTCGTGGtggactgctgaatccgttagccagcagccgcctccttattatcacttattcaggcgtagcaccagTCCGTCGGCTCCAATTACAC-3’；105

(2)根据锁式探针的连接段序列设计一对通用引物CF1和CF2，序列如下：

CF1：5’-CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3’，24

CF2：5’-GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3’；21

(5)锁式探针的连接反应：

连接反应体系的终浓度分别为：锁式探针分别为100pM-10μM，10×T4DNA LigaseBuffer 1μl，样品模板DNA 2μl，加双蒸水至反应总体积10μl，连接的条件为：在94℃下变性5min后，再加1U/μl T4 DNA Ligase，在16℃的条件下，反应10-60min；