[发明专利]PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA疫苗微球的制备方法。

背景技术

猪流感是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种猪的急性、传染性呼吸道疾病，传播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴发。因为猪流感病毒亚型较多、抗原易发生变异和可在种间传播，给流感疾病的预防乃至人类的健康带来很多挑战。所以猪流感在人流感和禽流感之间发挥着关键性作用，具有重大的公共卫生意义。

DNA疫苗是将含有编码抗原基因的真核表达质粒直接接种体内，在体内表达相应抗原刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，产生保护性免疫。目前，DNA疫苗大动物实验、人体临床实验结果表明：DNA疫苗存在着给药剂量较大，生物利用度低，免疫效果个体差异大，不够理想的缺点，极大地阻碍了DNA疫苗的研究进展。因此如何增强DNA疫苗的免疫效果、诱导产生粘膜免疫等课题是当前DNA疫苗研究的国际热点。国外DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究发展十分迅速，取得了不少阶段性成果，有的已进入临床实验。国内DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究工作开展较少，尤其是猪流感DNA疫苗黏膜免疫递送系统的研究还尚未见有报道。DNA疫苗黏膜免疫递送系统的研究结果已经显示出了巨大的应用潜力，微球/纳米粒递送系统具有靶向作用，对DNA疫苗具有保护作用，提高细胞转运效率，提高免疫效果并可经口服和鼻腔给药，诱导黏膜免疫等特点。因此，DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统是一个很好的递送系统，将促进DNA疫苗在畜牧业和临床的实际应用，届时用于预防、治疗、诊断动物和人的疾患，将拯救诸多病畜或病者的生命或延长其寿命，其经济效益和社会效益无疑是巨大的。目前，普通猪流感DNA疫苗的持续时间短，在体内易被降解，不能够实现缓释的目的。

发明内容

本发明的目的是为了解决现在猪流感DNA疫苗存在持续时间短，在体内易被降解，不能缓释的问题，而提供了PLGA(聚乳酸/羟基乙酸共聚物)猪流感DNA疫苗微球的制备方法。

PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法按以下步骤制备：

一、称取25mg的PLGA溶于0.75mL的二氯甲烷中，待完全溶解后加入40μl猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA溶液，冰浴条件下超声乳化10s，得初乳，然后在转速为7000r/min的条件下加入20mL质量浓度为2％的聚乙烯醇，得复乳；

二、复乳在转速为200r/min的条件下磁力搅拌5h，然后在转速为4000r/min的条件下离心10min，收集微球并用灭菌水洗涤3次，再置于-10～-50℃的条件下真空冷冻干燥，即完成PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备；其中步骤一40μl猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA溶液中有2mg猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA；步骤一中猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA的浓度为120μg/mL。

本发明以可生物降解材料聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)为载体，以猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA为模型药物，采用复乳化-溶剂挥发法制备PLGA猪流感DNA疫苗微球，通过考察超声乳化时间、乳化器搅拌速度、PVA的浓度、油相中PLGA的浓度(m/v)和DNA疫苗与PLGA比例(mg/mg)等影响因素，筛选出了粒径适宜、载药量大、包封率高、药物稳定性好、工艺简便、制备成本低、工艺重现性好、样品需要量少，较好保持了DNA疫苗的活性、具有适宜释药速率的PLGA猪流感DNA疫苗微球的制备方法，并且本发明中的处方和工艺也可放大到生产应用，因而对产业化的应用具有指导意义。

本发明制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球大小均匀，外形圆整，表面光滑，粒径为6.08±2.34μm，包封率平均为60％±3.8％，载药量平均为5.5％±0.5％；在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率，可以保持体内最佳的药物浓度，并且延长药物作用的时间；因此，实现了药物的缓释、靶向给药，具有重要的理论价值和实际应用前景，用于动物体或人体一些流行性疾病的预防、治疗和诊断，市场规模巨大，必将创造巨大的经济效益。

本发明制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球生物相容性和生物黏附性好，经黏膜免疫大大增强了猪流感疫苗的机体局部和全身的体液免疫及细胞免疫效果；同时克服了传统注射疫苗造成的顺应性差、注射器和针头导致感染、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且制备方法简单易行，条件温和，生产成本较低。

本发明制备的PLGA猪流感DNA疫苗微球可用于猪流感免疫，经口服给药，按体重免疫注射给药，给药量为95～105μg/100μL。

附图说明