[发明专利]一种水凝胶-纳米纤维膜及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种纳米纤维聚合物复合膜，其特征在于：其下层为水凝胶纳米纤维膜、中层为Matrigel基质胶层、上层为视网膜色素上皮细胞层。

2.根据权利要求1所述的纳米纤维聚合物复合膜，其特征在于：所述的视网膜色素上皮细胞层为单层；

或所述的水凝胶纳米纤维膜中由包含以下质量分数的组分制成：10-20％硫酸软骨素、0.05-0.1％H₂O₂和0.0003125-0.000625％辣根过氧化物酶和79.899375-89.9496875％的磷酸缓冲液。

3.一种上述权利要求1～2中任一所述的纳米纤维聚合物复合膜的制备方法，其特征在于：包含如下步骤：

(1)称取硫酸软骨素、H₂O₂和辣根过氧化物酶并充分混匀；

(2)将步骤(1)制备的混合物加到细胞培养板中，放置于培养箱中，然后在细胞培养板的每孔加入0.5-2mL视网膜色素上皮细胞培养基覆盖该混合物，于培养箱中过夜，制得水凝胶纳米纤维膜；

(3)将步骤(2)中细胞培养板的培养基吸掉，每孔铺上0.5-2mL稀释的基质胶Matrigel，放入培养箱2-4h，待用；

(4)吸除培养有视网膜色素上皮细胞培养板中的培养基，每孔加0.5-2mL磷酸盐缓冲液，除掉残留的培养基，再在每孔加0.5-1mL质量分数0.25％的胰酶-EDTA，放入培养箱2-5min，待85-95％细胞脱离板壁后，每孔加1-2mL视网膜色素上皮细胞培养基，吹打后转移离心管中；

(5)离心，去除上清，加1-2mL视网膜色素上皮细胞培养基悬浮细胞，并计数；将浓度为10⁴～10⁶个/mL的视网膜色素上皮细胞接种到步骤(3)中制备好的纳米纤维膜上；放置于培养箱中培养，每2-3天换视网膜色素上皮细胞培养基；

(6)待细胞有80-90％铺满培养板底后，将细胞连同聚合物膜及Matrigel切下，用于临床细胞移植。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中硫酸软骨素、H₂O₂和辣根过氧化物酶溶解在磷酸缓冲液中，其质量分数分别为10-20％、0.05-0.1％和0.0003125-0.000625％。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的视网膜色素上皮细胞培养基，包含以下组分：

α修饰最小必需培养基        500mL，

N1补充物                    5mL，

谷氨酰胺-青霉素-链霉素      5mL，

非必需氨基酸                5mL，

牛磺酸                      125mg，

氢化可的松                  10g，

三碘甲状腺原氨酸            0.0065g，

热灭活胎牛血清              25～75mL。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)的培养时间为3-5h。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的培养箱的条件为37℃，5％CO₂。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中Matrigel以磷酸盐缓冲液稀释，两者的体积比为1∶10-1∶20。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(5)中离心的操作条件为常温，转速为800-1500rpm，离心时间为3-5min。

10.一种上述权利要求1-2中任一所述的纳米纤维聚合物复合膜用于视网膜色素上皮细胞移植材料的用途。