[发明专利]芽孢杆菌L型诱导培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌L型的诱导培养基。

背景技术

细菌L型是细菌因变异而产生的细胞壁缺陷型，细菌细胞壁的缺陷可自发形成，也可人工诱导，诱导细菌变为L型的因素很多，如抗生素、中药等。

国内对细菌L型的研究主要集中在医学领域，由于抗生素的大量使用使得病原菌突变形成L型，L型病原菌可以具有致病性，但由于其缺乏细胞壁，青霉素等作用于细胞壁的抗生素对其没有作用，故L型的产生对疾病的治疗提出了新的挑战，因此国内关于L型的研究主要集中在病原菌L型的防治、检测等方面。

但在上世纪90年代，英国阿伯丁大学的研究[Artificially induced symbiotic associations ofL-form bacteria and plants[J].Journal of Applied But Feriology，1984，56(3)：465-477.The L-phaseof Erwinia carotovora var.atroseptica and its possible association with plant tissue[J].Jappl.Bact.，1973，36：729-737.)]表明：L型细菌在植物体内能够与植物形成内共生关系，并成功诱导了这种关系可使植物在受到病原体胁迫时，抗病效果大大提高，这些研究为植物病害的防治和抗病植物的育种提供了新的思路。蜡样芽孢杆菌是植物的一种益生菌，可以促进植物生长，并可以通过拮抗作用、竞争作用、诱导植物抗性等抵御植物病害。陈冲等人的研究(陈冲，王程亮，张潞生.蜡样芽孢杆菌TS-02防治草莓白粉病研究.安徽农业科学.2007，35(11)：3298，3300)表明，蜡样芽孢杆菌可抑制白粉病菌的定殖，从而达到防治草莓白粉病的效果。将蜡样芽孢杆菌诱导为L型，将L型导入植物体形成内共生，可以选育出对白粉病等植物病害具有抗性的新型植物品种。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成功率高、快速的芽孢杆菌L型诱导培养基。

一种芽孢杆菌L型诱导培养基，按照以下步骤制备：每900mL蒸馏水中溶有葡萄糖8-12g，胰蛋白胨8-12g，酵母粉4-6g，牛肉膏4-6g，氯化钠4-6g，琼脂9-10g，蔗糖160-180g，MgCl₂ 1.7-2.1g，在121℃条件下灭菌10-60min，所得培养基冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为1-5mg/mL，所述灭活马血清为使用前需在56℃灭活0.5小时。

本发明芽孢杆菌L型诱导培养基，按照以下步骤制备：每900mL蒸馏水中溶有葡萄糖10g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，琼脂10g，蔗糖170g，MgCl₂1.9g，在121℃条件下灭菌10-60min，冷却后加入灭活马血清100mL，再加入过滤除菌的溶菌酶使其终浓度为1-5mg/mL，所述灭活马血清为使用前需在56℃灭活0.5小时。

使用该芽孢杆菌L型的诱导培养基按以下步骤进行诱导：

1、将芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基中，28-32℃振荡培养至芽孢杆菌处于对数生长期；

2、取所得芽孢杆菌培养液，离心收集菌体，用高渗液洗涤两次后，将菌体悬浮于高渗液中使细菌浓度为(0.9-1.1)×10⁸CFU/mL，加入刚刚配置的溶菌酶使其终浓度与芽孢杆菌L型诱导培养基中的溶菌酶浓度相等，混匀，置于28-37℃的恒温条件下，当活体染色显示99％以上的菌体变为球形时，终止溶菌酶的作用，1500-2500r/min离心10-20min收集沉淀，用高渗液洗涤两次后，悬浮于悬浮液中使细菌浓度为(0.9-1.1)×10⁸CFU/mL，即得去壁菌悬液；

3、将灭菌后的芽孢杆菌L型诱导培养基冷却后倾倒平板，将去壁菌悬液轻轻的滴加在未凝固的芽孢杆菌L型诱导培养基平板上待平板凝固后，将平板倒置放入烛缸中，用CO₂烛缸法培养，在28-32℃的条件下，培养至菌悬液液滴内及液滴的边缘出现直径0.4-0.6mm的颗粒状菌落，验证菌落为L型菌落后，挑取同一菌落接种于新鲜的芽孢杆菌L型诱导培养基平板上，每3天转接一次，每次转接前均要验证所转接的菌落为L型，经过5-10次转接形成稳定的芽孢杆菌L型；

所述营养肉汤培养基的配方为：每1000mL蒸馏水中溶有牛肉膏3g、胰蛋白胨10g、氯化钠5g，用常用酸或碱溶液调节pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min。