[发明专利]一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法

说明书

发明领域

本发明涉及结构特异性化合物的制备方法，尤其涉及一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法。 

背景技术

1, 3-甘油二酯是天然食用油脂（甘油三酯）的结构类似物，其口感、外观均与前者一致，但在人体内的代谢吸收方式不同：甘油三酯经消化酶消化后生成单甘酯和游离脂肪酸，二者吸收进入血液后，很大部分重新合成甘油三酯而增加血脂或造成脂肪积累。而1, 3-甘油二酯经消化酶作用后生成甘油和游离脂肪酸，甘油经丙酮酸进入 TCA 循环，游离脂肪酸被运往肝脏进行 β-氧化。因此，食用含有1, 3-甘油二酯的油脂具有降低脂肪积累、防止体重增加的效果。 

天然存在的 1, 3-甘油二酯很少，因而其人工合成尤显重要。鉴于 1, 3-甘油二酯主要用作健康食用油脂，其合成过程中必须尽量避免酸、碱、有机溶剂等有害成分的参与以及高温、高压等苛刻条件对产品口感、外观的不良影响，因而适宜利用脂肪酶的区域选择性在无溶剂条件下由甘油和高级脂肪酸直接酯化是来合成高纯度的 1, 3-甘油二酯。已有利用游离脂肪酶催化合成 1, 3-甘油二酯的报道 [ 孟祥河, 邹冬芽, 段作营等. 无锡轻工大学学报, 2005, 23(2): 31-35 ]。 

但是无溶剂合成 1, 3-甘油二酯的反应为高黏度非均相体系，这造成了脂肪酶在应用中活力低、稳定性差、回收重复利用困难的问题。本实验室曾采用表面修饰的疏水硅藻土为载体 采用多种方法对 Arthrobacter sp. 脂肪酶进行固定化，发现通过疏水修饰脂肪酶的活力有显著提高 [ Yang G, Wu J-P, Xu G, et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2008, 2009, 57(1-4): 96-103 ]。此外，磁性材料为酶在高黏度体系中的回收重复利用提供了方便，刘薇等以磁性基质固定化的脂肪酶，具有出很好的分离效果 [ 刘薇, 白姝, 孙彦. 过程工程学报, 2004, 4(4): 362-366. ]。 

为了同时解决脂肪酶在高粘度非均相体系中的若干问题，我们尝试将疏水性修饰聚合物及磁性基质结合起来，对脂肪酶进行固定化。目前，尚无将疏水性磁性多孔聚合物固定化脂肪酶应用于无溶剂体系中 1, 3-甘油二酯合成的尝试的报道。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法。 

磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法包括如下步骤： 

1)向 200 mL 无氧水中加入0.20~0.30 mol三价铁盐和 0.10~0.15 mol二价铁盐，超声处理 20~30 min；升温至 65~90 ℃，在 800~ 1 200 rpm 搅拌下，N₂ 鼓泡 20~30 min，加入7.5~10 mL 质量分数 25~28%的氨水或 10 ~15mL 10 mol/L NaOH，15~30 min 后，磁分离，无氧水洗涤至 pH = 7；

2）加入4.5~9 mL 表面活性剂混合，65~90 ℃、800~1 200 rpm 搅拌 1~2 h，用甲苯洗涤3~5次，加入2~15 mL 甲苯混合形成磁流体；

3）取70 mL的质量比为 4~6:3~5:200的 NaCl、聚乙烯醇和水，及 10 mL 的质量比为6~7:1:0.17~0.20的疏水性单体、交联剂和环己烷，加入2~15 mL磁流体混合，超声处理 5~15 min， N₂ 鼓泡、800~1 200 rpm 搅拌 10~15 min，升温至 72~77 ℃ 并加入引发剂引发聚合，回流 3.5~7 h ，磁分离，用甲醇洗涤3~5次，真空干燥，得到磁性多孔聚合物微球载体；

4)将含有 10~50 mg 脂肪酶的水溶液与 10~50 mg 磁性多孔聚合物微球载体混合，0~4 ℃、180~220 rpm搅拌 5~12 h ，磁分离，冻干 8~12 h，得到磁性多孔聚合物固定化脂肪酶；

5)将40~100 mg甘油和200~500 mg脂肪酸与 10~35 mg 4 ? 分子筛、10~50 mg脂肪酶混合，在 30~40 ℃、180~220 rpm 搅拌下反应 7~24 h，得到 1, 3-甘油二酯。