[发明专利]一种赤藓红色素的人工抗原的制备方法

说明书

技术领域

一种赤藓红色素的人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

赤藓红，英文名称为：Erythrosine，其化学名称为：螺异苯并呋喃-1(3H),9’-[9H]占吨-3-酮-3’,6’-二羟基-2’,4’,5’,7’-四碘代二钠盐，也叫四碘荧光素B，CAS号568-63-8，分子式是C₂₀H₆I₄Na₂O₅。赤藓红是人工合成色素中的一种，色泽鲜艳，常用于食品加工制品和饮料中，以提高其感官性。食品着色剂可分为天然色素和人工合成色素两大类，因人工合成色素具有成本低廉、色调多样、色泽亮艳和着色力强等特点，故在食品加工业中被广泛采用。由于合成色素以苯、甲苯、萘等化工产品为原料，经过磺化、硝化、卤化、偶氮化等一系列有机反应制成合成色素。因此，食用合成色素多为含有R-N=N-Rc 键、苯环或氧杂蒽结构化合物，它们对人体存在一定的不安全性或者产生有害作用，过多食用会危害人体健康。毒理学研究发现，某些合成色素有慢性毒性或致癌性，故各国都严格控制其使用范围和使用量。因此，近年食品添加剂已成为食品安全问题的一个关注焦点。2008年4月，英国食品标准局拟议禁止在食品内添加6种人工合成色素：日落黄、柠檬黄、胭脂红、诱惑红、喹啉黄、偶氮玉红，因其能够引起多种儿童多动症的症状，比如过度活跃、注意力不集中等。欧盟食品安全局也对此高度重视，并开展相关物质的风险评估研究。目前赤藓红的毒理学研究表明赤藓红对小鼠的生殖和神经行为有轻微影响，并且赤藓红能对雄甾酮和对硝基苯酚的葡萄糖苷酸化和糖酯化起到抑制作用，此外还会降低肝细胞中的葡萄糖异生作用和尿素生成作用。合成色素有严格的控制使用范围和最大使用量。并鉴于其潜在严重危害性，因此食品中合成色素的准确测定具有重要意义。现今赤藓红主要的分析方法有：高效液相色谱法、毛细管电泳法、LC-MS、LC-MS/MS、GC/MS、阴离子交换色谱法，示波极谱法及薄层色谱法等。现有的仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长，因此有必要研究特异性强，灵敏度高同时价格低廉，能快速简便的免疫检测技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。目前为止，国内外尚没有针对赤藓红结构残留的免疫检测方法的报道，为此设计合成了以赤藓红的衍生物ETS为半抗原的用于赤藓红人工合成色素检测的完全抗原。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于人工合成食用色素赤藓红的人工抗原制备方法。所制备的产品用于赤藓红结构的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了更好的必需的人工抗原以产生针对赤藓红有更高特异性的抗体。

本发明的技术方案：一种赤藓红衍生物ETS人工抗原的合成方法，以赤藓红衍生物ETS为半抗原，用活性酯法将其与载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，用紫外扫描仪测定偶联物的偶联比。

（1）半抗原的制备

制备赤藓红衍生物ETS：取88mg (0.1mmol )赤藓红和0.11mmol的盐酸在水溶液中避光反应6h，离心取沉淀并用N,N-二甲基甲酰胺DMF稀释，然后加入0.5mL的含有0.1mmol六氨基己酸的水溶液以及0.15mmol碳化二亚胺EDC和0.15mmolN-羟基硫代琥珀酰亚胺Sulf-NHS避光反应24h，离心取上清得到赤藓红衍生物ETS。

（2）赤藓红衍生物ETS人工抗原的合成：

取0.5mL含有20mg（0.02398mmol）赤藓红衍生物ETS的N,N-二甲基甲酰胺DMF溶液到棕色小瓶中，再加入15.52mg（0.06807 mmol）N-羟基硫代琥珀酰亚胺Sulf-NHS和17.32mg（0.09033 mmol）碳化二亚胺EDC，室温反应8h，为A液。将32.5mg（0. 0005mmol） 牛血清蛋白BSA溶解到0.01M、pH7.4的磷酸盐PBS缓冲液中，为B液。然后将A液缓慢滴加到B液中，室温反应6h，离心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液。

透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。

将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的磷酸盐PBS溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到赤藓红衍生物的人工抗原：ETS-牛血清白蛋白。

（3）赤藓红衍生物人工抗原的鉴定