[发明专利]弓形虫IgG抗体与总抗体联合检测试剂条及其制备方法

权利要求书

1.弓形虫IgG抗体与总抗体联合检测试剂条，其特征在于设有第1试剂条和第2试剂条；

所述第1试剂条设有第1载体板、第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜、弓形 虫IgG抗体检测线、第1对照线和第1吸收垫；第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维 膜和第1吸收垫依次粘贴在第1载体板上表面，第1加样垫的一端设在第1胶体金垫的一端 上，第1胶体金垫的另一端设在第1硝酸纤维膜的一端上，第1吸收垫的一端设在第1硝酸 纤维膜的另一端上，弓形虫IgG抗体检测线和第1对照线依次设在第1硝酸纤维膜上；在弓 形虫IgG抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在第1对照线处包被羊抗 弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体；

所述第2试剂条设有第2载体板、第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜、总抗 体检测线、第2对照线和第2吸收垫；第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜和第2 吸收垫依次粘贴在第2载体板上表面，第2加样垫的一端设在第2胶体金垫的一端上，第2 胶体金垫的另一端设在第2硝酸纤维膜的一端上，第2吸收垫的一端设在第2硝酸纤维膜的 另一端上，总抗体检测线和第2对照线依次设在第2硝酸纤维膜上；在总抗体检测线处包被 抗人Ig单克隆抗体，在第2对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2 和GRA7的IgG抗体。

2.如权利要求1所述的弓形虫IgG抗体与总抗体联合检测试剂条，其特征在于所述第1 试剂条的第1加样垫与第2试剂条的第2加样垫之间用玻璃纤维膜连接。

3.如权利要求1所述的弓形虫IgG抗体与总抗体联合检测试剂条，其特征在于所述第1 载体板和第2载体板为PVC板。

4.如权利要求1所述的弓形虫IgG抗体与总抗体联合检测试剂条的制备方法，其特征在 于包括以下步骤：

1)制备弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7

采用基因克隆技术，PCR扩增编码弓形虫抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得 弓形虫重组抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；

2)硝酸纤维素膜的点样

在弓形虫IgG抗体检测线上包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在总抗体检测线 处包被抗人Ig单克隆抗体，在第1试剂条的第1对照线和第2试剂条的第2对照线处分别包 被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体，晾干；

3)制备胶体金

采用柠檬酸三钠还原方法制备25nm胶体金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去离子双 蒸水中，得到的氯金酸浓度为0.01％，置于带冷凝装置的烧瓶中加热至沸腾，磁力加热搅拌 下加入1％柠檬酸三钠水溶液2.0mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶 中4℃冰箱保存备用；

4)胶体金与SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记

(1)胶体金与弓形虫抗原SAG1(P30)的标记：取胶体金10m L，用0.1mol/L NaOH调 至pH5.4，加100μg SAG1(P30)，混匀，放置5min，加入5％BSA 1m L混匀，4℃、10000r/ min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10m L，4℃、10000r/min离心1h， 弃上清，沉淀用TBS稀释至1mL，得胶体金标记的SAG1(P30)抗原；

(2)胶体金与弓形虫抗原SAG2(P22)、ROP2和GRA7的标记方法与步骤(1)相同， 得胶体金标记的SAG2(P22)、ROP2和GRA7抗原；

(3)将胶体金标记的SAG1(P30)抗原、胶体金标记SAG2(P22)、胶体金标记ROP2和 胶体金标记的GRA7抗原混合后，均匀地涂于玻璃纤维膜上，烘干，制备成胶体金垫；

5)制备免疫层析检测条

第1试剂条设有第1载体板、第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜、弓形虫IgG 抗体检测线、第1对照线和第1吸收垫；第1加样垫、第1胶体金垫、第1硝酸纤维膜和第 1吸收垫依次粘贴在第1载体板上表面，第1加样垫的一端设在第1胶体金垫的一端上，第1 胶体金垫的另一端设在第1硝酸纤维膜的一端上，第1吸收垫的一端设在第1硝酸纤维膜的 另一端上，弓形虫IgG抗体检测线和第1对照线依次设在第1硝酸纤维膜上；在弓形虫IgG 抗体检测线处包被抗人IgG特异性片段γ链单克隆抗体，在第1对照线处包被羊抗弓形虫抗 原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗体，用切条机切成条状，得弓形虫IgG 抗体与总抗体联合检测试剂条的第1试剂条；

第2试剂条设有第2载体板、第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜、总抗体检 测线、第2对照线和第2吸收垫；第2加样垫、第2胶体金垫、第2硝酸纤维膜和第2吸收 垫依次粘贴在第2载体板上表面，第2加样垫的一端设在第2胶体金垫的一端上，第2胶体 金垫的另一端设在第2硝酸纤维膜的一端上，第2吸收垫的一端设在第2硝酸纤维膜的另一 端上，总抗体检测线和第2对照线依次设在第2硝酸纤维膜上；在总抗体检测线处包被抗人 Ig单克隆抗体，在第2对照线处包被羊抗弓形虫抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7 的IgG抗体，用切条机切成条状，得弓形虫IgG抗体与总抗体联合检测试剂条的第2试剂条。