[发明专利]一种用于定量分析生物样品中反义寡核苷酸的新方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物检测领域。具体而言，本发明涉及基因药物及其代谢物的定量分析，更具体说，本发明涉及用于定量分析生物样品中反义寡核苷酸及其代谢物的新方法。

发明背景：

以反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)和核酸刺激基序(CpG)为代表的小分子核酸药物在基因治疗中占据着越来越重要的地位，该类药物在极低剂量下给药即能发挥药效。迄今，已有ASODN和CpG药物通过美国FDA批准上市，更有多种该类药物处于临床前和临床试验。因此，建立生物基质中高灵敏度和样品前处理简单的高通量定量分析方法对于评价临床前及临床研究阶段生物样品中小分子核酸药物的药代动力学行为至关重要。

目前生物样品中ASODN定量分析的非放射性同位素标记手段中，毛细管凝胶电泳(Capillary gel electrophoresis，CGE)和高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是应用最为成熟和广泛的方法。目前的报道研究中，CGE方法检测对于血浆中ASODN的最低定量限(Lower limit of quantification，LLOQ)可达到70μg·L^-1(约12nmol·L^-1)，在组织中的LLOQ为6μg/g(分子量为6500，100nmol·L^-1)。HPLC方法的分辨率和灵敏度均略低于CGE。两种方法的共同缺点是样品处理过程复杂，绝对回收率较低，分析成本较高，应用有所限制。重要的是，方法灵敏度无法满足小剂量(≤mg·Kg^-1)给药情况下对血浆和组织分布中末端消除相ODN的定量要求。因此，迫切需要与之适应的高灵敏度和高通量定量分析方法进行药代动力学评估。

近年来，基于定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术的发展，出现了系列高灵敏度的核酸检测方法，但这些方法多是针对微小RNA和短干扰RNA类核酸或基于klenow酶的PCR技术对DNA寡核苷酸的定量分析(CN 101611153A，CN 101835903A)，虽然可满足生物基质中检测灵敏度要求，但该方法不能对反义寡核苷酸与其代谢物分别定量，无法精确评价寡核苷酸类药物在生物体内的代谢与动力学情况，限制了该方法在临床或临床前药代动力学研究中的应用。

Wei等人(pharm Res，2006.23(6)，p.1251-1264)报道的研究中，描述了对血浆和细胞裂解物基质中硫代磷酸寡核苷酸原形的定量分析方法，然而寡核苷酸类药物临床前药代动力学行为的评价需要更适用于各种生物组织和体液中的定量方法；此外，寡核苷酸类药物的结构特点要求一种能在生物基质中区分代谢物的定量方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种能够定量分析生物样品中反义寡核苷酸及其代谢物的新方法。

本发明为核酸分子杂交的酶联桥接法(Enzyme-linked bridging assay，ELBA)，主要基于核酸杂交原理，利用一个锚定的、3’端与待测ODN序列互补的捕获探针俘获生物基质中的ODN，再通过T4DNA连接酶将检测探针(序列与捕获探针5’端互补，3’端偶联酶标发光检测系统)与上述核酸杂交复合物相连，建立桥接体系。S1核酸内切酶是单链特异性的核酸内切酶，可以降解双链核酸中的单链或缺口处切割双链DNA，在上述桥接体系中，可以通过酶切将不能与检测探针连接从而构成完整双链的差减ODN序列(即ODN的5’或3’降解产物，其3’端与检测探针5’端之间有1个以上的碱基缺口)去除，以保证桥接系统的序列长度特异性，做到对ODN原形或者降解产物的分别定量。本发明对复杂生物基质(各种组织和体液)的样品前处理简单，可以满足生物样品中各种组织和体液来源的寡核苷酸类药物定量要求，并具有对寡核苷酸类药物与其代谢物具有分别定量能力，因此本发明在适用性、特异性上更具优势。