[发明专利]一种用于肝细胞培养的无血清培养基

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养用培养基，具体涉及一种用于肝细胞培养的无血清培养基。

背景技术

肝脏作为人体中最重要的器官之一，承担着合成、分泌、代谢、解毒等多种复杂的功能。一旦由各种原因造成肝细胞的大量坏死，将会出现肝衰竭，导致机体代谢紊乱和毒性物质的堆积，而这反过来又加重了肝细胞的损伤，影响肝细胞的再生，进而形成肝衰竭的恶性循环。急性肝功能衰竭是一种严重的肝脏疾病，死亡率高达60～90％。目前，对此最有效的治疗方法为肝脏移植。然而，由于供体器官缺乏、费用高昂、需长期使用免疫抑制剂等原因，往往在等待供体过程中，病人由于病情进展而迅速死亡，极大地限制了肝移植手术的广泛开展。因此，以培养肝细胞为基础的生物型人工肝技术成为终末期肝病患者向原位肝移植顺利过渡、以及给急性肝功能衰竭患者受损肝脏提供得以再生和修复时机的重要手段。

目前认为，生物人工肝要达到理想支持效果，至少需要1010以上数量级的有较好功能的细胞，同时细胞自身及其生长的环境不能对人体产生负面的影响。然而动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞不能增殖。血清的主要作用在于提供细胞生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，维持细胞较好的生长状态，促进细胞的生长与分裂增殖。

然而经研究发现，细胞培养中使用血清存在着多种缺点：首先，具有批间差异，不同批次血清间的生物活性和因子不一致，将会导致产品和实验结果的重现性差，进而需要大量验证工作；其次，血清的来源不稳定、成分不明确、以及有抑制生长的成分，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化；再者，存在污染外源病毒和致病因子的风险，容易被病毒和支原体感染；进一步，制品中残留的牛血清易引起被接种者对血清的过敏反应，不利于动物实验或者临床试验等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于肝细胞培养的无血清培养基，其可在同等条件的肝细胞培养过程中有效地代替血清成分，提供细胞生长增殖所需的充足营养与良好环境，使细胞生长良好，并使细胞形态、密度、活力、功能与含血清培养基基本相同，以克服现有技术的不足。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于肝细胞培养的无血清培养基，其包含基础培养基和添加组分。其中，所述添加组分包括：胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、表皮生长因子、肝细胞生长因子、纤粘连蛋白、地塞米松和胰高血糖素。上述添加组分中的各组分在该无血清培养基中的浓度为：

该基础培养基为DMEM/F12(DMEM NUTRIENT MIX F12)培养基、DMEM高糖培养基等培养基。

在本发明中，该胰岛素可通过作用于肝细胞表面的胰岛素受体，增强肝细胞对葡萄糖的摄入和利用，同时促进肝细胞内的RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，从而增强肝细胞的活力与功能。

该转铁蛋白的主要作用为调节体内铁元素的代谢，通过细胞表面的转铁蛋白受体将铁元素转移到细胞内。同时，该转铁蛋白还可以与其他微量元素，如钒等结合，从而调节肝细胞的生长增殖与功能表达。

该亚硒酸钠作为人体的必需微量元素硒的存在形式，起到保护细胞免受氧化应激的作用。

该表皮生长因子和肝细胞生长因子的主要作用为促进肝细胞的增殖，以及调节肝细胞的功能。

该纤粘连蛋白的主要作用为促进肝细胞的粘附，及其贴壁生长。

该地塞米松和胰高血糖素是体内重要的激素，参与肝细胞的糖代谢、脂类代谢等，能调节肝细胞的增殖与功能表达。

其中，该地塞米松是通过乙醇溶解获得的，具体的方法为：称取地塞米松粉末39.2mg，然后加入10ml的无水乙醇溶解，再加入无菌蒸馏水稀释100倍，在4℃的温度中保存备用。

该表皮生长因子是通过水溶解获得的，其具体制备方法为：称取表皮生长因子200ug，然后加入20ml灭菌蒸馏水溶解，在-20℃温度中保存备用。

该肝细胞生长因子是通过水溶解获得的，其具体制备方法如下：称取肝细胞生长因子25ug，然后加入10ml灭菌蒸馏水溶解，在-20℃温度中保存备用。

进一步，所述无血清培养基中还可含有HEPES，即4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸，其浓度为10mmol/L。该HEPES主要起到控制无血清培养基在较长的时间内保持恒定的PH值范围的作用。