[发明专利]一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR检测分析技术领域，尤其涉及了一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的实时荧光PCR试剂及方法。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森氏菌能致人和其它多种动物发生胃肠炎、关节炎、败血症及结节性红斑等病，是非常重要的人畜共患病病原。该细菌在我国的分布非常广泛，从人群、动物、外环境和食品都可以分离出病原菌。该病与人们日常生活关系密切，流行病学研究表明，小肠结肠炎耶尔森氏菌能在冷藏温度下生长繁殖，故冰箱是耶尔森氏菌小肠结肠炎重要的传染源，俗称“冰箱菌”。

传统的分离鉴定方法检验小肠结肠炎耶尔森氏菌，从中温增菌到确定细菌的血清型、生物型大约需要1周的时间，不仅费力而且需要时间长。近年在PCR基础上发展起来的荧光定量PCR不仅继承了传统PCR的优点，避免了其检测过程容易污染环境容易造成假阳性的缺点，具有检测过程简便快速，结果敏感特异等特点。PCR是聚合酶链式反应英文缩写，其英文全称为Polymerase Chain Reaction，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。如公开号CN101200760A（申请号200710115174.2）公开了耶尔森氏菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。该专利公开的试剂盒内包括环介导等温扩增反应液A、BstDNA聚合酶B、显色剂C；反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-CCGGTTTGATCGGTTTCGCCCACAAGATGGGTGTGCC-3、下游内引物5-GTGCGTTTCTGGCCGAGCTTGCAGACGTTTTGCCAGGATT-3、上游外引物5-CGCCGTGAAGGTAAAGTTCA-3、下游外引物5-CAGAGTTCAGGAACGACAGC-3和甜菜碱；检测方法包括待测样品或者细菌DNA的提取、耶尔森氏菌的环介导等温扩增反应和显色检测。《农产品加工》2008(11).-37-37报道，瑞典和芬兰的研究人员建立了一种新型食品检测方式，可快速、精确地对食物携带的病菌进行探查，这将为食品安全的监督提供有效帮助。研究人员利用TaqMan探针实时定量PCR（聚合酶链反应）法对食物中的小肠结肠炎耶尔森氏菌进行探查，但是没有具体研究内容。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简便快速、灵敏准确、适用于大量样本检测的小肠结肠炎耶尔森氏菌试剂盒及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

检测小肠结肠炎耶尔森氏菌荧光PCR试剂盒，试剂盒中的试剂包括前引物、后引物、TaqMan探针、荧光PCR预混液、ROX校正液、纯水和阳性标准液；所述前引物的核酸序列是5’-AATGCTGTCTTCATTTGGAGC-3’，所述后引物的核酸序列是5’-ATCCCAATCACTACTGACTTC-3’，所述TaqMan探针的核酸序列是5’-CAAGCAAGCTTG TGATCCTCCG-3’； 所述前引物、后引物和TaqMan探针的摩尔数比为1:1:1；

所述的前引物、后引物和TaqMan探针是根据小肠结肠炎耶尔森氏菌特异、保守基因核酸序列合成并能与之特异结合的20～21碱基的DNA片段，TaqMan探针5’端用荧光基团异硫腈酸荧光素标记，3’端用淬灭基团标记。

所述TaqMan探针的5’端标记物为6-羧基琥珀酰亚胺酯,3’端标记物为6-羧基四甲基若丹明。

所述荧光PCR预混液包括PCR 扩增缓冲液，DNA 聚合酶和镁离子，和dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP 4种脱氧核苷混合物。此荧光PCR预混液可以在市场上购买得到。

所述荧光PCR预混液含4 种dNTP 的摩尔数配比为dATP:dCTP:dGTP:dTTP=l:l:l:l。

所述试剂盒的荧光PCR 扩增的目标模板为小肠结肠炎耶尔森细菌DNA。

所述试剂盒的PCR反应程序是95℃ 30秒酶活化后，95℃ 5～10秒变性，60℃ 30～60秒退火、延伸、荧光信号采集，35～40个循环。

所述纯水为三蒸水或去离子水，所述阳性标准液的菌体浓度为10⁷cfu/ml，所述ROX校正液的主要成分是罗丹明，罗丹明是可用作生物荧光染色剂的一种由三苯甲烷衍生的染料，其别名有：玫瑰红123和2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester。