[发明专利]真核表达并纯化人源化抗血管内皮生长因子单克隆重组抗体(Anti-VEGF)的简便化工业技术

说明书

技术领域

本发明涉及真核表达并纯化人源化抗血管内皮生长因子单克隆重组抗体(Anti-VEGF)的简便化方法。

背景技术

血管内皮生长因子(VEGF)是以二硫键连接的二聚体糖蛋白，分子量为35～40kDa。VEGF是一个细胞因子家族，包括VEGF-A、-B、-C、-D、-E和胎盘生长因子等多个成员。VEGF-A基因的选择性剪切可以产生至少5种蛋白形式，包括分泌型可溶性蛋白VEGF121、VEGF145、VEGF165。血管内皮生长因子通过特异性与3个血管内皮生长因子受体结合，启动下游细胞信号级联，刺激内皮细胞增殖，促进细胞迁移，并抑制细胞凋亡。血管内皮生长因子主要表达于血管内皮细胞、肿瘤细胞、某些炎症细胞和间质细胞。血管内皮生长因子的表达水平和肿瘤内的血管生成情况和肿瘤的转移风险。因此，抑制血管内皮生长因子信号转导可以抑制多种肿瘤的发生和发展。

如今，随着基因工程技术的发展，抗VEGF抗体已经可以由多种方式获得。目前市面上多为多克隆抗体或单克隆抗体，鲜见重组抗体。传统的抗VEGF抗体制剂生产的纯化步骤繁琐，纯度也较低，使得其经济意义大为降低。本发明通过基因工程技术，获得了人源化抗血管内皮生长因子单克隆重组抗体。

发明内容

本发明的目的在于实现人源化抗血管内皮生长因子单克隆重组抗体在真核细胞中的大量表达，并通过简化的纯化步骤，获得纯度较高抗体。在工业生产中满足生产周期短，生产成本低，产量高的总体要求。

本发明通过体外人工合成双链DNA分子的技术，分别合成人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体重链和轻链的编码基因，通过EcoRI和XhoI限制性酶切位点与表达载体pCDNA3.1连接。随后将质粒转染293T细胞系获得高效表达。

附图说明

图1是转染后人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体表达SDS-PAGE电泳分析结果图(M为marker；1.转染空载体的阴性对照；2.转染48小时后2ml培养基抗体表达情况(还原条件下)；3.转染96小时后2ml培养基抗体表达情况(还原条件下))。

图2是Anti-VEGF SDS-PAGE分析纯化纯度结果图。(A非还原条件，B还原条件)。

具体实施方式

1、人源化抗血管内皮生长因子单克隆重组抗体的真核表达

编码人源化抗血管内皮生长因子单克隆重组抗体重链和轻链的编码基因通过EcoRI和XhoI限制性酶切位点与表达载体pCDNA3.1连接。随后将质粒转染CHO-K1细胞系。

转染前48小时，将10ml活力大于95％、细胞密度为1.5*10⁵/ml的CHO-K1细胞用含DMEM完全培养基(无抗，含10％胎牛血清)平铺于10cm细胞培养皿，在37℃，5％CO2培养箱中培养。当细胞汇合度达到70-80％时，开始转染。将含抗血管内皮生长因子单克隆抗体重链和轻链基因的表达载体各1μg，加入到200μl 37℃预热的PBS中，混匀后加入4μl1mg/ml PEI(聚乙烯亚胺)，立即震荡混匀，在室温下放置15分钟。将质粒-PEI混合液加入到细胞培养液中，轻轻混匀后在37℃，5％CO2培养箱中培养。6小时后，吸弃细胞培养液，并用37℃预热的PBS洗细胞3次去除残留的血清之后；加入10ml无血清培养基，同时加入终浓度分为2mM和1mM的谷氨酰胺(L-Glutamine)和丙酮酸钠继续培养。分别于48小时和96小时收集细胞上清。

人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体表达SDS-PAGE电泳分析结果见附图1。

2、Protein A亲和层析纯化抗体

将共计10个细胞培养皿收集所得上清200ml；10000rpm，4℃离心10min去除细胞等沉淀物，并用等体积PBS稀释1倍。将0.5ml ProteinA纯化树脂用5ml PBS平衡后，将细胞培养上清以流速0.5ml/min上柱。5ml PBS洗涤去除非特异结合蛋白后，用100mM pH3.0甘氨酸溶液洗脱蛋白。用1M Tris-HCl pH9.0将蛋白洗脱液pH调至中性，之后在PBS透析至少4小时。用PEG20000浓缩至浓度为1mg/ml，经液氮冷激后于-80℃冰箱保存。最终获得蛋白的量为0.8mg。

SDS-PAGE验证获得的是高纯度的蛋白，蛋白纯度＞95％见附图2。