[发明专利]原核表达并纯化人来源的肿瘤坏死因子α(TNF-α)的简便化工业技术

说明书

技术领域

本发明涉及原核表达并纯化人来源的肿瘤坏死因子α(TNF-α)的简便化方法。

背景技术

肿瘤坏死因子(TNF)是一个分子家族，包括来源于巨噬细胞的TNF-α和来自淋巴细胞的TNF-β，具有抗肿瘤、抗病毒以及免疫调节等多种生物活性。目前重组人TNF已经成功地在体内、外显示抗肿瘤活性，其最大特点是能专一杀伤肿瘤细胞而不损伤正常细胞。TNF在治疗肿瘤等方面的应用已经进入到临床II期实验阶段。

TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，LPS是较强的刺激剂。人来源的TNF-αcDNA编码一个含有233个氨基酸残基的前体，经加工后形成含有157个氨基酸残基的活性形式。TNF-α具有一个二硫键，但是二硫键的打开不影响其活性。

目前已经发现两种TNF受体，分别是I型TNF-R和I型TNF-R，属于神经生长因子超家族。其中I型受体可能在溶细胞活性上起主要作用；而II型受体可能与信号传递和T细胞增殖有关。

如今，随着基因工程技术的发展，TNF-α已经可以由多种细胞株中获得表达。然而，传统的TNF-α制剂生产的纯化步骤繁琐，得率不高，纯度也较低，使得其经济意义大为降低。

发明内容

本发明的目的在于实现人来源的TNF-α在原核细胞中的大量表达，并通过简化的纯化步骤，获得纯度较高的目的蛋白。在工业生产中满足生产周期短，生产成本低，产量高的总体要求。

本发明通过体外PCR扩增的方法，从人来源的TNF-α的cDNA中扩增得到TNF-α基因，并通过NcoI和EcoRI限制性酶切位点与表达载体pET-28a连接。随后将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)获得高效表达。

附图说明：

图1是TNF-α诱导表达SDS-PAGE电泳分析结果图(M为marker；1诱导前，2四小时诱导后)。

图2是TNF-α超声细胞破碎SDS-PAGE电泳分析结果图(M为marker，1为上清，2为沉淀)电泳图中显示，上清和沉淀均有TNF-α。

图3是TNF-α阴离子交换层析各个步骤流出液SDS-PAGE电泳结果图

A图是第一次阴离子交换层析SDS-PAGE电泳结果图(M为marker，1破菌后上清，2流穿液，3洗涤液，4-13洗脱液收集组分)。

B图是第二次阴离子交换层析SDS-PAGE电泳结果图(M为marker，1-7第7至13管洗脱收集组分(每管6ml))。

图4是TNF-α经Superdex 75纯化峰图。

图5是TNF-α分子筛纯化收集组分SDS-PAGE电泳结果图(1-10分别对应图4中收集组分A2-A11)。

图6是TNF-αSDS-PAGE分析纯化纯度结果图。

具体实施方式

1、TNF-α的原核表达

编码人来源的TNF-α基因通过NcoI和EcoRI限制性酶切位点与表达载体pET-28a连接。随后将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。

挑取单克隆并接入含有3ml LB和终浓度为100μg/ml卡那霉素的培养基中，摇床37℃，250rpm培养约16小时。将上述菌液按1∶200的比例接入含有200ml LB和终浓度为100μg/ml卡那霉素的培养基中，摇床37℃，250rpm培养至OD600约为0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导4小时之后收菌，离心，4000rpm，20min，弃上清，菌体于-80℃保存。TNF-α诱导表达SDS-PAGE电泳分析结果见附图1。

结论：TNF-α理论分子量为17.3kDa，图中条带符合目的条带大小。

2、阴离子交换层析纯化目的蛋白

收集的菌体置于冰上融化，并按1∶20(m/v)比例悬浮于Lysis buffer(50mM Tris pH 8.0，150mM NaCl，2mM PMSF，5mM EDTA，1mM DTT)中加入终浓度为1mg/ml的溶菌酶，置冰放置30min。细胞经超声破碎仪裂解(450w，破碎9.9s，停9.9s，共15次)。离心13000rpm，30min以除去细胞碎片等杂质。收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳检测蛋白的可溶性(电泳结果显示该蛋白为可溶蛋白，但包涵体中也有部分目的蛋白。由于包涵体需要繁琐的复性过程，所以本发明只纯化上清液中的目的蛋白。)。TNF-α超声细胞破碎SDS-PAGE电泳分析结果见附图2。