[发明专利]一种稀少糖核苷酸的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种稀少糖核苷酸的制备方法，特别涉及一种利用糖核苷酸合成酶制备稀少糖核苷酸及其衍生物的方法，属于糖核苷酸合成技术领域。

技术背景

糖核苷酸(sugar nucleotide)又称活性糖，在化学结构上是单糖的还原端和核苷一磷酸或二磷酸的末端磷酸基团结合形成的化合物。糖核苷酸是生物体内一类重要的化合物，参与生物体内重要物质的合成和代谢过程，尤其是作为糖基转移酶反应必需的底物，参与生物体的糖基化过程。

生物体内有九种常见糖核苷酸。糖核苷酸的制备方法有化学合成和生物酶法合成两种。化学法合成糖核苷酸，主要是采用有机合成的策略，通过多步保护/脱保护/选择性修饰等化学反应过程，制备糖核苷酸，存在步骤繁琐、产率低等问题。生物酶法合成是解决糖核苷酸供给不足的一种有效手段，目前，九种常见糖核苷酸都能够通过生物酶法催化反应制备得到，但一种生物酶只能催化合成一种特定糖核苷酸，限制了糖核苷酸的制备和应用；此外，近年来，随着糖核苷酸研究领域的深入发展，部分肿瘤细胞、病原微生物中发现有结构上区别于九种常见糖核苷酸的稀少糖核苷酸，这类稀少糖核苷酸被认为具有潜在的治疗、诊断等应用前景，但稀少糖核苷酸的制备比较困难，目前主要依赖化学合成方法制备获得。

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是引起肠胃疾病的主要细菌，能够导致严重的神经疾病。本世纪初，研究发现空肠弯曲菌中存在一个类似真核生物的N-糖基化途径，这也是目前细菌中发现的唯一N-糖基化途径，这个新发现的糖基化系统可以用于开发疫苗，降低空肠弯曲菌相关疾病的发病率。空肠弯曲菌糖基化系统的发现及模式菌C.jejuniNCTC11168测序工作的完成，开辟了糖核苷酸合成研究的新领域。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，以一种具有底物选择广泛性的糖核苷酸合成酶为基础，提供一种稀少糖核苷酸的制备方法。

发明概述

本发明的技术要点是利用空肠弯曲菌C.jejuniNCTC 11168来源的一种能够催化尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)生物合成的糖核苷酸合成酶，以酶的天然底物及其衍生物做催化反应底物，一步酶法合成系列糖核苷酸及稀少糖核苷酸。

术语说明：

糖核苷酸合成酶的活力单位(U)：在特定反应体系及条件下，以每分钟生成1μmol产物UDP-GlcNAc的酶量为1个糖核苷酸合成酶的活力单位(U)。

上述特定反应体系如下：取含20％甘油、pH 7.5，10mM Tris-HCl缓冲液配制的糖核苷酸合成酶液10μL，加100mM N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸溶液5μL(pH 7.5，10mM Tris-HCl缓冲液配制)、100mM尿苷三磷酸溶液5μL(pH 7.5，10mM Tris-HCl缓冲液配制)、100mMMgCl₂溶液5μL、0.5U焦磷酸水解酶(Pyrophosphatase)，pH 7.5，10mM Tris-HCl缓冲液补足体积至100μL。

上述特定反应条件如下：

37℃反应10min，100℃沸水浴5min终止反应，13,400rpm离心15min。上清用毛细管电泳仪检测。

发明详述

一种稀少糖核苷酸的制备方法，步骤如下：

(1)将糖-1-磷酸(Sugar-1-Phosphate)溶于Tris-HCl缓冲液，制得浓度为100mM的糖-1-磷酸溶液；

将核苷三磷酸(Nucleoside triphosphate，NTP)或脱氧核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP)溶于Tris-HCl缓冲液，制得浓度为100mM的核苷三磷酸溶液或脱氧核苷三磷酸溶液；

(2)将步骤(1)制得的糖-1-磷酸溶液与核苷三磷酸溶液或脱氧核苷三磷酸溶液分别按反应体系终浓度4～10mM的添加量加入到反应容器中，再按反应体系终浓度4～10mM的添加量添加MgCl₂、反应体系终浓度4～10IU/mL的添加量添加焦磷酸水解酶、反应体系终浓度4～10U/mL的添加量添加糖核苷酸合成酶，Tris-HCl缓冲液补足体积，得反应体系，在30～42℃的条件下，反应1～3小时，沸水浴终止反应，10,000～13,400rpm离心10～20min，取上清，过0.22～0.45μm的滤膜，得滤液；

(3)将步骤(2)制得的滤液，经色谱分离、冷冻干燥，制得稀少糖核苷酸。