[发明专利]利用微流控芯片筛选蛋白质的核酸适体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸适体的筛选方法，尤其涉及一种利用特定装置筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法。

背景技术

核酸适体（aptamer），也称为核酸适配子，是经过一种新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化技术（SELEX）筛选得到的，其是从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异性结合靶物质的单链寡聚核苷酸，可以是DNA也可以是RNA，长度一般为25～60个核苷酸。核酸适体的出现，打破了传统意义上关于核酸只是遗传信息存储和转运载体的认识，利用核酸结构的多样性，可使核酸适体高效、特异地结合各种靶分子。核酸适体具有易合成、易修饰、易存储等优点，可广泛用于蛋白质的分析检测、生物传感器、分子开关的开发、医学诊断治疗等方面。但是由于常规的SELEX方法中的筛选轮数一般为8～20轮，有时甚至需要30轮才能筛选出一条可以应用的核酸适体，所以目前已筛选出的核酸适体种类较少，只有几百种。因此，为了获得更多种核酸适体，有必要提高其筛选效率。

微流控芯片，也称芯片实验室（Lab-on-a-chip），是利用微电子机械系统技术（Micro-electro-mechanical Systems，MEMS）在玻璃、硅和有机高分子聚合物等基片表面，构建微管、微池、微泵等分析单元和系统，或基于芯片毛细管电泳技术，以实现样品进样、生物和化学反应、预浓缩、分离和检测等功能，微流控芯片具有快速、高效、高通量、低成本、低样品量、可批量分析等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种通用性强、筛选时间短、筛选效率高、筛选效果好的利用微流控芯片筛选蛋白质的（特异性）核酸适体的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法，包括以下步骤：

（1）优化核酸文库：将预先设定的起始核酸文库先与非靶标蛋白质孵育，得到用于靶标蛋白质核酸适体筛选的优化核酸文库；

（2）修饰微珠：将所述靶标蛋白质先与微珠孵育，将修饰有靶标蛋白质的微珠置入一微流控芯片通道内；

（3）初筛：将所述优化核酸文库通入所述微流控芯片通道内，该通道内的微珠上修饰的靶标蛋白质与所述优化核酸文库中部分核酸分子结合，经过在该微流控芯片通道内的冲洗、洗脱，得到与所述靶标蛋白质结合的初筛核酸文库；

（4）纯化：将上述得到的初筛核酸文库进行PCR扩增，扩增产物通过链霉亲和素微珠填充的亲和柱进行分离，再通过碱变性解链、脱盐后形成次一级核酸文库；

（5）循环：以上述得到的次一级核酸文库替代所述起始核酸文库并重复上述的步骤（1）～步骤（4），直至得到包含有与所述靶标蛋白质高亲和力和高特异性结合的核酸适体的核酸文库。

上述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法中，所述靶标蛋白质可以为血液中的各种常规蛋白质。根据我们的实验结果，所述血液中的常规蛋白质优选为肌红蛋白或C反应蛋白。

上述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法中，优选的所述起始核酸文库主要包含70～80个碱基的DNA序列，该DNA序列两端优选为15～20个碱基的引物序列，该DNA序列中段优选为40个碱基的随机序列，所述起始核酸文库容量优选在10¹⁴以上。

上述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法中，所述非靶标蛋白质优选是指与所述靶标蛋白质同族或相似的蛋白质，或者是与所述靶标蛋白质在同一环境或体系中的蛋白质。

上述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质特异性核酸适体的方法中，优选的，所述微流控芯片的通道两端分别设有进样口和出样口，所述通道上设有收缩段以形成一用于阻挡微珠通过的狭窄通道。所述通道的宽度优选在150μm以上，通道的高度优选在50μm以上，所述收缩段的高度优选为10μm～18μm，所述微珠（优选聚苯乙烯微珠）的粒径优选为20μm～40μm。

上述的利用微流控芯片筛选靶标蛋白质核酸适体的方法中，步骤（2）中的微珠孵育后可优选用封闭剂封闭，所述封闭剂优选为牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）或脱脂奶粉 。