[发明专利]一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法。

背景技术

质谱法是目前用于蛋白质高效准确检测的一种新技术新方法，其检测灵敏度和准确度高，可同时获得定性定量的结果，还可用于多种蛋白的同时测定。近年来质谱技术发展很快。随着质谱技术的发展，质谱技术的应用领域也越来越广。由于质谱分析具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点，因此，质谱技术广泛的应用于化学，化工，环境，能源，医药，运动医学，刑侦科学，生命科学，材料科学等各个领域。

目前，蛋白质组研究的实验技术流程一般为样品(蛋白混合物)经二维凝胶电泳，染色，胶上蛋白酶切，进入质谱鉴定；或样品(蛋白混合物)直接经酶切，色谱分离，进入质谱进行鉴定。在二维凝胶电泳的实验中，可以通过比较染色后的2张2DE-gel图像中蛋白点的光密度值进行差异定量，或比较同种蛋白经同位素标记和未经标记的串联质谱峰面积进行差异定量。但这两种常用技术由于在样品处理上费时费力，不利于大规模的蛋白质组定量。因此，兴起了无标记的质谱定量方法，这种方法只需分析大规模鉴定蛋白时所产生的质谱数据，用蛋白相应肽段的质谱数据进行定量，因此，非标记定量技术在定量蛋白质组学研究中受到了众多科学工作者的推崇。

非标记蛋白定量检测技术的优势：

1、无需昂贵的同位素标签做内部标准，实验耗费低。

2、对样本的操作也最少，从而使其最接近原始状态，并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种牛血清白蛋白非标记质谱定性、定量检测方法，步骤如下：

(1)蛋白的酶解：将50μg待检测的蛋白样品溶于8.34μL含有尿素、DTT和NH₄HC0₃的水溶液中，置于37℃水浴中还原4h，然后加入0.84μL碘乙酰胺溶液，放置暗处1h，进行烷基化，再加58.34μL NH₄HCO₃溶液稀释尿素，最后加入1μg胰蛋白酶，37℃保温反应16h，反应结束后，冷冻干燥成粉末备用；

所述含有尿素、DTT和NH₄HCO₃的水溶液中，含有尿素、DTT和NH₄HCO₃的水溶液中，尿素的浓度为8M，DTT的浓度为10mM，NH₄HCO₃的浓度为50mM；

所述碘乙酰胺溶液中碘乙酰胺的浓度为0.5M；

所述NH₄HCO₃溶液的浓度为50mM；

(2)液相色谱检测：对上述蛋白的酶解产物进行液相色谱检测，蛋白酶解产物的进样量不低于100ng(进样时，进样浓度范围为0.1mg/mL～5mg/mL)，液相的梯度条件为：0-5min，B相保持5％；5-45min，B相从5％升至45％；45-50min，B相从45％升至95％；50-55min，B相从95％降至5％，柱后平衡10min；流速为0.2-0.6mL/min；

(3)定性检测：定性检测的肽段为：HLVDEPQNLIK，检测蛋白的酶解产物中是否含有该肽段，若有，则证明待检测的蛋白样品为牛血清白蛋白，若没有，则证明待检测的蛋白样品不是牛血清白蛋白；

(4)定量检测：定量检测的肽段为：ATEEQLK，检测蛋白的酶解产物中该肽段的浓度，通过以下公式计算得出牛血清白蛋白的浓度：在蛋白浓度为10μg/mL-500μg/mL的线性范围内，该肽段的浓度与丰度线性方程为：y＝51925x-491814，R₂＝0.9991，其中，x：牛血清白蛋白的浓度，y：肽段ATEEQLK的丰度。

所述步骤(2)中，选用Agilent-1200色谱系统，流动相A为含0.1％(体积百分数)甲酸的水溶液，B为含0.1％(体积百分数)甲酸的乙腈溶液；分析柱为Agilent Poroshell 120SB-C18色谱柱，规格为3.0mm×150mm，粒径2.7μm。