[发明专利]一种脑肿瘤干细胞分离方法

说明书

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体地说是一种脑肿瘤干细胞分离方法。

背景技术

脑肿瘤干细胞(Brain cancer stem cells，BCSCs)研究的首要问题就是如何从异质性的脑肿瘤细胞群中分离出极少量的BCSCs，目前主要有以下几种分离BCSCs的方法。

1、利用BCSCs表面的人白细胞分化抗原133(CD133)标记分子进行筛选：

常用的筛选方法有荧光激活细胞分选术(FACS)和磁性激活细胞分选术(MACS)。其中FACS法是目前应用较广泛的分离方法，通过荧光标记的CD133特异性抗体与细胞表面CD133分子结合后，将能发出荧光的BCSCs分选出来。

2、利用生物学特性进行功能分选(SP细胞分选)：

用能结合DNA的荧光染料烟酸己可碱33342(Hoechst 33342)处理细胞，利用肿瘤干细胞可将染料泵出细胞不发出荧光的性质，经过FACS分选，将不被染色或低染色的侧群细胞(SP细胞)筛选出来。但是SP分选法中用到的荧光染料对BCSCs可能有一定的毒性作用，会使分离出的BCSCs的活性与功能发生改变，影响后续的培养研究。

上述1、2这两种分选方法均还存在如下不足：过程繁琐，时间冗长，费用也比较昂贵，且都存在一定的主观性，可因细胞的制备方法、设门(gating)等不同而有所差异，存在一定的误差，最重要的是经过长时间染色和分选后细胞的活力必然会受到影响，进而影响下一步的培养或者生物学特性研究。

3.利用BCSCs体外成神经球生长的特性进行分选：

脑肿瘤细胞在添加了生长因子的无血清神经干细胞培养基中生长，其中的BCSCs增殖而形成致密球状，保持不分化状态；而脑肿瘤非干细胞则贴壁生长，且在无血清条件下生长速度缓慢。有科学家将脑肿瘤手术标本制成单细胞悬液后，用无血清神经干细胞培养基(DMEM/F12培养基+B27添加剂+表皮生长因子(FGF)+表皮生长因子(FGF))进行培养可形成肿瘤球，此肿瘤球细胞经过免疫组化检测显示细胞表面高表达CD133和巢蛋白(nestin)分子(两者均为正常神经干细胞的表面标记)，且肿瘤球中的部分细胞移植到免疫缺陷小鼠体内可致瘤，说明脑肿瘤球中存在一定比例的BCSCs。但是BCSCs在体外悬浮培养的过程中有可能分化成脑肿瘤非干细胞，且利用已有方法得到的BCSCs纯化程度低(20％～30％)，不能很好地满足后期大量研究的需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种脑肿瘤干细胞分离方法，该方法既能抑制脑肿瘤干细胞的分化并促进其增殖分裂，又能杀死脑肿瘤非干细胞亚群，获得大量高纯度脑肿瘤干细胞。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种脑肿瘤干细胞分离方法，包括如下步骤：

获取原代脑肿瘤细胞；

原代脑肿瘤细胞的消化传代：将所述脑肿瘤细胞接种至第一无血清干细胞培养基中，再加入蛋白酶体抑制剂MG-132进行培养后，用第一无血清干细胞培养基进行换液，然后加入多烯紫杉醇和阿霉素进行二次培养，获得原代脑肿瘤球细胞；蛋白酶体抑制剂MG-132在第一无血清干细胞培养基中的含量为10～25μmol/L；

原代脑肿瘤球细胞的收集传代：将所述原代脑肿瘤球细胞洗涤收集，再接种至第二无血清干细胞培养基中进行培养传代，获得所述的脑肿瘤干细胞；其中，所述第二无血清干细胞培养基中含有重组白血病抑制因子ESGRO。