[发明专利]用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒。

背景技术

酮体是脂肪代谢的产物，正常人体内的每个细胞均含有脂肪酸，当体内需要更多的能量，如超出摄入食物产生的葡萄糖能提供的能量时，就要求脂肪细胞释放脂肪酸进入血液，然后脂肪酸被运输到肝脏转化为酮体。该酮体包括丙酮、乙酰乙酸和β-羟丁酸，这三者处于动态平衡之中。其中β-羟丁酸含量最多，可占酮体总量的75％。酮体和血糖一样，是检测代谢控制的一项重要的标记物。I型糖尿病病人的最重要的特征之一就是易发展成为酮症酸中毒，酮症酸中毒是一种威胁生命的疾病，因此及时准确地检测酮体水平是十分关键的预知酮症酸中毒的重要手段。此外，酮体还是监测糖尿病控制和诊断酮症酸中毒以及监测治疗的重要标志物。

特别是糖尿病孕妇易发展成为高酮体水平，这可能极大的影响胎儿的生长发育。在糖尿病控制不良的孕妇中，母体酮血症与死胎率增高相关，并且会削弱婴儿的神经生理功能的发展。另外监测血酮体对控制酮源性饮食也十分必要。

目前，酮体试验普遍采用的是以硝普盐反应为基础的定性或半定量检测，并且只检测乙酰乙酸或丙酮；其中乙酰乙酸只占酮体23％且不稳定，丙酮占酮体2％。而且，该方法采用的是化学法，因此造成灵敏度低、特异性差，有较高的假阳性或假阴性结果。此外，在糖尿病酮症发生早期，β-羟丁酸有明显升高，而乙酰乙酸尚无明显反应；在酮症酸中毒恢复期，β-羟丁酸迅速下降时，乙酰乙酸在一定时间内仍然保持下降缓慢。因此，β-羟丁酸测定在糖尿病控制好坏的预告中比乙酰乙酸更敏感、可靠。同样，在糖尿病酮症及其他碳水化合物代谢障碍的诊断、监测与治疗中，也是一个很好的指标。

β-羟丁酸检测方法有高效液相色谱法、化学方法和酶法，其中酶法测定血清β-羟丁酸因具有准确、简便、快速、灵敏和特异的特点，受到临床的广泛重视。目前有2种方法，其一是酶动力学法，在辅酶I(NAD⁺)存在的条件下，β-羟丁酸在β-羟丁酸脱氢酶的作用下生成乙酰乙酸、还原型辅酶I(NADH)及氢离子，反应生成的还原型辅酶I(NADH)在340nm吸光度的变化可以间接反映病人血清中的β-羟丁酸的浓度。其反应过程如下：

另一方法为循环酶比色法，是在β-羟丁酸脱氢酶反应基础上偶联黄递酶，使色原(硝基四氮唑蓝，氧化型INT)生成红色色素(还原型INT)，在505nm处测定吸光度的变化，计算样品中β-羟丁酸的含量。其反应过程如下：

相比之下，循环酶比色法因偶联了一个酶，其灵敏度较动力学法提高了10倍，线性范围也大为提高，并且由于反应是循环往复的进行的，因此减少了原料的投入量，降低了成本。但由于循环酶比色法试剂中氧化型INT溶解度差且不稳定，目前国内试剂公司大部分采用三试剂法，即临用时将含有硝基四氮唑蓝的溶液混入试剂1中，并且此混合液在2～8℃仅能稳定30天，相比之下，操作步骤复杂且试剂稳定性远不及动力学法。同时由于测定易受乳酸、抗坏血酸治疗的影响，致使其在临床上的大规模推广应用受到限制。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种稳定、线性范围大、测量准确度和精密度高、抗干扰性强的用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒，用来判断人体酮症酸中毒程度。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒，该试剂盒为由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中

试剂1(R1)各组分及浓度为：

试剂2(R2)各组分及浓度为：

本发明上述试剂1中的缓冲液为Tris缓冲液、GOOD’S缓冲液、三乙醇胺缓冲液等中的一种，优选三乙醇胺缓冲液(盐酸三乙醇胺缓冲液)。

本发明上述试剂2中的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液等中的一种，优选醋酸-醋酸钠缓冲液。

本发明的表面活性剂为Tween 20、Tween 80、Brij 35、Triton X-100等非离子表面活性剂中的一种。

本发明的稳定剂是多元醇(如甘露醇、丙三醇等)、BSA(N，O-双三甲硅基乙酰胺)、β-环糊精、甘露醇等中的一种。

本发明的抗干扰剂I和抗干扰剂II均为选自草酸盐、草酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)、维生素C氧化酶、谷胱甘肽等中的一种。