[发明专利]具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒

说明书

技术领域

本发明涉及介孔二氧化硅纳米颗粒，具体涉及含有酸敏感的具有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物和异硫氰酸荧光素的双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。 

背景技术

真核细胞内存在pH分布与细胞器特异相关这一特征，例如，细胞质是近乎中性的（pH7.2）而溶酶体内则呈酸性（pH 6.0-4.0）。溶酶体内的酸性环境对于真核细胞的内吞、自吞噬、细胞凋亡等生物学过程至关重要，在诸如细胞成熟、癌细胞扩散等过程中都能观察到溶酶体酸性改变这一现象，因此检测溶酶体内的pH对于科学研究有着重要意义。基于单个发光团的单荧光强度法在实际应用中有很多不足，例如加入量所造成的实验误差大；不可定量测量等。与此相比，比率荧光法则由于引入内参而避免了这些问题。即：在某一个对pH敏感的分子上，同时引入一个对pH不敏感的探针作为分子内参。目前已经有多种基于此方法的探针。例如，在荧光素上配对有罗丹明，量子点以及其他染料作为内参。 

目前已有报道含有分子内酰胺环的罗丹明衍生物在中性环境下没有荧光，而在酸性环境中由于分子内酰胺开环会生成具有强荧光的氨基罗丹明，这说明这类罗丹明衍生物是一种对pH有良好响应的染料。然而，基于这种染料的pH荧光比率探针还没有报道。介孔二氧化硅是一种具有良好生物兼容性和稳定性的纳米颗粒，可以利用细胞的内吞作用特异地聚集在溶酶体内。含有分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物是一种随pH降低荧光强度显著升高染料，与之相反，荧光素是随着pH降低而荧光强度显著降低。 

有鉴于此，本发明提供一种具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，利用分子内酰胺环的罗丹明6G衍生物和异硫氰酸荧光素对pH的不同响应，实现灵敏的pH比率测定。 

发明内容

本发明提供一种具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒。利用罗丹明6G和异硫氰酸荧光素对pH的不同响应，实现灵敏的pH比率测定。 

为了实现上述目的，本发明的解决方案如下： 

具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，它是由含有分子内酰胺环的罗丹明6G和异硫氰酸荧光素共同负载在二氧化硅上形成的介孔二氧化硅纳米颗粒。

上述的具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒，，其制备方法包括： 

先由罗丹明6G在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(简称：APTS)中经过氨解得到含有分子内5-员内酰胺环的衍生物N-(罗丹明6G)-内酰胺-3-氨基丙基三乙氧基硅烷（简称：R6G-APTS）；再由异硫氰酸荧光素与（3-氨丙基）三乙氧基硅烷通过氨基反应生成异硫氰酸荧光素-3-氨基丙基三乙氧基硅烷（简称FITC-APTS）；最后，将N-(罗丹明6G)-内酰胺-3-氨基丙基三乙氧基硅烷（简称：R6G-APTS）和异硫氰酸荧光素-3-氨基丙基三乙氧基硅烷（简称：FITC-APTS）加入到由四乙氧基硅烷、十六烷基三甲基溴化铵（简称：CTAB）和助剂组成的混合溶液中反应，除去杂质后制得产品（简称：R6G-FITC-MSN）。

以及，具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒作为检测细胞溶酶体内pH值的应用。 

R6G-APTS 与FITC-APTS的合成路线表示如下： 

本发明的具有双荧光标记的介孔二氧化硅纳米颗粒（R6G-FITC-MSN）的合成路线如图1所示。

罗丹明6G（R6G，以下简称R6G）在3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTS，以下简称APTS）中氨基水解后反应生成无色、不发荧光的R6G-APTS。FITC和APTS的氨基反应生成FITC-APTS。将R6G-APTS和FITC-APTS放入四乙基原硅酸盐（TEOS，以下简称TEOS）和十六烷基三甲基溴化铵中浓缩得到R6G-FITC-MSNs ，经过除去CTAB和其他溶剂后得到R6G-FITC-MSNs纳米颗粒。通过透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）显示R6G-FITC-MSNs纳米颗粒呈多孔状，大小均一，平均直径约100 纳米。 

对R6G-FITC-MSNs进行表征，表征结果如图2所示。 

在图2中，图A、图B、图C和图D分别表示为： 

A：R6G-FITC-MSN在pH 7.5, 7.0, 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 和 3.5 缓冲溶液中的荧光发射光谱（FITC的激发波长为488nm, R6G-amide的激发波长为530 nm）; 横坐标为荧光发射波长，纵坐标的荧光发射强度；