[发明专利]不对称多孔吸附珠粒

说明书

本申请是于2006年9月19日递交的发明名称为“不对称多孔吸附珠粒”、申请号为200610138801.X的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及适合于色谱应用的不对称多孔珠粒。

背景技术

诸如蛋白质、多肽和生物分子片段的生物分子已经成为制药和诊断应用的重要试剂。目前，生物分子的纯化经常涉及包括色谱处理的多个步骤。用于生物分子分离的多孔色谱介质的合成和使用有完善的文献记录。所述色谱步骤经常通过使用珠粒填充床来进行，产品和杂质得以与原料流分离。这些珠粒通常为含有官能或用官能改性的基体(如多醣、合成聚合物或材料、陶瓷、玻璃或上述材料的复合物)，官能通过化学或物理方法与生物分子相互作用；它提供结合或相互作用的“驱动力”。该复杂组合的相互作用导致介质在要求的分离中的表现。介质影响生物分子间特定分离的能力经常被称作“介质的选择性”。通常这些基体表现出可使所关心的生物分子进入粒子内部容积的孔隙。所述内部的孔隙率在粒子内是均匀的。

色谱分离典型地在填充有微粒型珠粒形式的分离基体的柱子内进行。介质粒子的大小支配分离动力学，但较小的粒子会产生高的反压。为了能够分离大分子，所述粒子应具有大的孔隙，但大的孔隙降低所述粒子的机械稳定性，尤其是对于诸如琼脂糖的多糖而言。多糖是具有优势的，因为通常它们与蛋白的结合力低，易于官能化，并且能够形成多孔结构。传统上，多糖珠粒由一种多糖与在整个珠粒内具有均匀的或“对称的”多孔结构制得。这些“对称”珠粒的实例包括(纤维素)、(琼脂糖)和(葡聚糖)。所述对称的珠粒在珠粒的整个内部结构内与分子结合。内部结构内的化学环境(孔径大小、疏水性、配体类型和配体密度)基本上是均匀的。因此所述珠粒的整个结合环境的性质是均匀的。在这些体系中，分离的驱动力来自被吸附生物分子间结合强度的差异。典型地当使用对称树脂时，通过控制缓冲条件优化结合强度是实现所要求分离的唯一驱动力。此外，多糖材料内在是可压缩的，并经常要求进行化学改性如通过交联来减少其可压缩性。

对称树脂的另一特性是介质的机械强度，机械强度是由材料、孔隙结构和化学改性等所造成的。典型地对于多糖而言，介质孔径越小，则由于较高的固体材料浓度(孔隙率更低)而使其机械强度越高。然而，孔径越小，较大物种(如IgG)进入吸附剂的传质就越容易受阻。因此，对称介质的设计经常涉及粒子刚性和生物分子传质的优化/妥协。事实上，由于对称珠粒的渗透率是所述粒子的尺寸及粒径分布所造成的，所以该优化问题更加复杂。随着粒子尺寸变小，粒子的外表面积增大，因此传质也增加。在洗提期间，较小的粒子可使离开介质的扩散时间更短，因此产生更集中和窄的洗脱峰。然而，传质的该改进是以渗透率为代价的，这就限制了柱的大小和介质的物料通过量。

在许多生物分子的分离中，考虑的物种(目标分子)是原料中浓度最高的物种。换言之，杂质只占要分离的全部混合物中的很小比例。对于对称的色谱介质，分离经常受目标分子与一些杂质结合的影响，然后通过应用洗提条件来区分所述物种，以分离杂质。如果两个物种与介质的结合强度十分相似，那么即使蛋白质的大小不同，分离也十分困难。在某些情况下，分离的困难状态是由有限数量的影响纯化的驱动力因素所造成的。最终结果是，由于分离不完全，纯化蛋白的收率低，或者还必须需要另一个色谱步骤使用具有不同分离驱动力的不同介质来进一步纯化目标分子。这样的方法费时、低效且昂贵。

对于包括膨胀床或流化珠粒色谱的应用，填充的多糖珠粒相当成熟。通常这些材料通过在珠粒形成期间向多糖(典型地为琼脂糖)加入实心的或非多孔的小球而制造。这样，就可以形成包裹在多糖材料内的具有一个或多个非多孔粒子的珠粒。另一种常用的技术是用最终要成为吸收剂材料的涂敷固体粒子。所述固体粒子对珠粒的蛋白容量或分离性能没有作用。通常粒子的作用仅在于改善珠粒的密度，以便所述材料可用于非填充床的应用。在某些情况下，固体粒子提供刚性和/或减少的凝胶体积。

最近，为了避免大分子的结合及同时保持对较小物种的容量，已经开发了带有所谓非吸收性多糖的“盖子”或外层材料来限制进入的多孔结构。这些材料具有非常低的对大分子的容量，因为其内表面积不能同时供两个物种结合。

以前的工作表明可以以不对称的方式用化学改性来改进对称多糖的结构。该技术可以在珠粒内产生变化的化学环境。典型地，所述改性可用于在珠粒外面上提供中性层。这可防止在珠粒外面堵塞，尤其是在脏的原料流如在膨胀床吸收(EBA)中所遇到的。然而，该技术不改变珠粒的孔径，因此在整个珠粒内产生的是对称的孔径。