[发明专利]一种利用激流式生物反应器悬浮培养动物细胞的工艺过程及控制方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程技术，涉及动物细胞大规模培养及生产重组蛋白药物的工艺，具体涉及动物细胞无血清高密度，高表达悬浮培养工艺过程控制方法。

背景技术

动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一，并随着重组治疗性蛋白类药物的广泛应用而迅速发展。目前工业化生产动物细胞表达重组蛋白治疗药物的主要方法是通过生物反应器，在体外大规模高密度培养杂交瘤细胞、工程细胞、昆虫细胞和微生物等，再通过相关的纯化手段制备重组蛋白产品。

用于细胞大规模培养的生物反应器有搅拌式生物反应器，气升式生物反应器，中空纤维生物反应器，固定床式生物反应器，旋转式生物反应器，一次性生物反应器。[SINGH Vijay.Disposable bioreactor for cell cumture using wave-induced agitation[J].Cytotechnology，1999，30：149-158.][2]SlivacI，V G，K，I and Kniewald Z 2006Aujeszky’sdisease virus production in disposable bioreactor[J].Biosci.31：363-368.]搅拌式生物反应器的最大优点是能培养各种类型的动物细胞，培养工艺容易放大，产品质量稳定，适合于工业化生产，在生物制品开发中潜力很大。但这种生物反应器也有不足之处，即机械搅拌会产生高剪切力，对细胞造成某种程度上的损伤。气升式生物反应器能在通气的同时，利用其独特的回路循环装置使液相达到循环。最常见的为管道或板柱内循环气升式生物反应器。外循环气升式反应器，将下降管置于反应器外部，可用于高细胞浓度灌注培养。缺点相对来说较少，主要是高密度培养时混合不够均匀。中空纤维生物反应器的主要组成部分是一充满培养液的闭合管道，管道中插入半通透性的中空纤维。中空纤维为培养细胞提供营养物质并运走代谢废物。但是细胞密度过高会妨碍氧的扩散，使细胞的得氧量不同。同时，此反应器中还存在着营养物质和代谢产物的浓度差，这就导致了细胞生长的不均一性。[李宝香，郭德伦，张莹三维细胞培养技术及相关仪器的进展和应用]填充床生物反应器中填充了某种材料，作为固定细胞的载体，填料颗粒堆叠成床。培养液可以在床层中流动。它没有机械搅拌和气泡，所以剪切力小，适合细胞培养。但该反应器的最大缺点是混合效果差，传质、传氧效率低。[动植物细胞培养生物反应器的研究进展王志江，郑裕国旋转式生物反应器(RCCS)主要由控制装置和培养容器两部分组成。培养容器主要由内外两个圆筒组成，内、外筒可相对独立地旋转。整个容器由电机驱动沿水平轴旋转，细胞颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道。由于该系统无推进器、空气升液器、气泡或搅拌器，细胞颗粒不与容器壁或任何其它易致伤的物体相碰，故几乎没有破坏性的剪切力。普通生物反应器由于通过搅拌保持细胞的悬浮而产生的剪切力破坏了细胞间和细胞与基质问的稳定，使组织和细胞集中于自身的修复，而大大影响其生长和其它的正常生理功能。由于有很好的物质交换功能，细胞在RCCS中能以很高的密度生长，其细胞的培养密度可达到10⁸，故可快速大规模地培养细胞。此外，这种培养能提供本能的分化、高细胞增殖、低的细胞死亡率和增加细胞产物的分泌。[Fang A，Pierson D L.Mishra SK.etal.Growth of Streptomyces hygroscopicusinrotating wall bioreactor under simulated microgravity inhibits rapamycin production[J].Appl Microbiol Biotecknol.2000，54：33.]一次性生物反应器是最近发展起来的新式反应器，由预先消毒的、可被FDA认可的、对生物无害的聚乙烯塑料箱组成，箱中部分填充培养液并接种细胞，箱中其余部分是空气。使用前箱体用r射线消毒，用后丢弃。特殊的开孔可进行无菌加样、取样，而不必把生物反应器置于层流罩中，装置简单，易于操作，成本低，低剪切力，无空气鼓泡减低了气泡对细胞的损害，可用于培养动物细胞和植物细胞并十分适合生产病毒。此反应器已经成功悬浮培养重组NSO细胞生产单克隆抗体；悬浮培养人293细胞生产腺病毒；用昆虫sf 9细胞生产棒状病毒；用微载体Cytodex 3培养人293细胞。[林福玉，陈昭烈等.大规模动物细胞培养的问题及对策.生物技术通报.1999，1：32-35.]