[发明专利]琥珀酸高产菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于工业菌筛选及应用技术领域，具体涉及琥珀酸高产菌株的筛选及其应用，即利用基因工程方法，同时结合代谢工程改造和传统诱变技术获得高产菌株，并将筛选到的大肠杆菌用于琥珀酸的发酵生产。 

背景技术

琥珀酸又称丁二酸，广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品、塑料等行业，也可以作为C4平台化合物，合成一些重要的化工产品如丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯、n-甲基吡咯烷酮(NMD)、2-吡咯烷酮等，还可用来合成可降解的生物聚合物，如聚丁烯琥珀酸(PBS)和聚酰胺(过程工程学报(2007)4，840-846)。目前琥珀酸的市场需求量高达2.7×10⁷t/a(Appl Microbiol Biotechnol2007，76，727-740)。传统上，琥珀酸是使用化学法合成；但因为石油价格的持续上涨，微生物发酵法生产琥珀酸的研究越来越引起人们的兴趣。目前的生物法生产的琥珀酸成本在0.55-1.1$/Kg，完全可以与化学路线竞争。因此很多大公司都积极投入研发力量，进行生物法琥珀酸的生产和应用开发，如日本的Mitsubishi Chemical和荷兰的帝斯曼DSM等。 

在众多的琥珀酸生产菌中，目前研究最多的是Actinobacillus succinogenes，Mannheimia succiniciproducens，Anaerobiospirillum succiniciproducens和大肠杆菌(Appl Microbiol Biotechnol 2007，76，727-740)。大肠杆菌(Escherichia coli)是兼性厌氧菌，在厌氧条件下进行混合酸发酵，主要的发酵产物有乳酸、乙酸、乙醇、甲酸、琥珀酸等，但琥珀酸的产量很低，但是大肠杆菌由于遗传背景清楚，遗传操作工具丰富，很多研究组对其进行代谢工程改造用于生产琥珀酸。 

目前在工程菌上已开展了一些工作，包括通过降低乳酸脱氢酶活性来减少副产物乳酸的生成(JP11-206385A)，使用乙酰磷酸转移酶(pta)和乳酸脱氢酶(ldh)缺陷的大肠杆菌生产琥珀酸(WO 99/06532)。在大肠杆菌突变株AFP111(ptsG，pflAB，ldhA)中过量表达外源丙酮酸羧化酶(pyc)，在复合培养基中好氧厌氧两步法生产琥珀酸，产量达99.2g/L，生产速率为1.30g/L/h，副产物乙酸为9.7g/L，乙醇为4.7g/L。(Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology(2002)28，325-332)。大肠杆菌突变株SBS550MG(adhE，ldhA，iclR，ack-pta)和SBS990MG(adhE，ldhA，ack-pta)过量表达外源丙酮酸羧化酶，在复合培养基中好氧生长的菌体离心重悬至OD值为10，琥珀酸对葡萄糖的摩尔得率分别达到1.6和1.5mol/mol，乙酸副产物分别为0.13和0.26mol/mol，甲酸副产物分别为0.08和0.09mol/mol。SBS550MG过表达外源pyc，在LB培养基中补充葡萄糖，接种量OD值为17，厌氧发酵约95小时，琥珀酸产量约为40g/L，甲酸副产物约 2.5g/L(CN1202930A)。大肠杆菌突变株KJ32(ldhA，ackA，adhE，focA，pflB，mgsA)经过代谢进化后基本培养基厌氧发酵120小时，琥珀酸产量733mM，主要有乙酸副产物250mM；KJ73(ldhA，ackA，adhE，focA，pflB，mgsA，poxB)经过代谢进化后基本培养基厌氧发酵96h，琥珀酸产量668mM，主要有乙酸副产物183mM(US20100184171)。因此，已有的工程菌都存在大量的副产物，副产物的存在，不仅降低了碳的有效转化效率，并且大幅增加分离提取工艺的复杂度、废水废液量，造成琥珀酸整体生产成本居高不下，妨碍生物法琥珀酸的工业化进程。因此，如何筛选出既能保持琥珀酸产量，又能有效减少副产物的发酵菌株就成为目前研究的热点。 

发明内容

本发明的目的是提供琥珀酸高产菌株及其应用，即通过理性设计与非理性诱变相结合获得能够有效减少副产物的琥珀酸生产菌，并利用该菌株生产琥珀酸，以弥补现有技术的不足。