[发明专利]酵母展示型聚半乳糖醛酸酶协同超声波处理提取紫菜多糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示型聚半乳糖醛酸酶协同超声波处理提取紫菜多糖的方法。

背景技术

紫菜含有丰富的由聚半乳糖醛酸硫酸酯组成的活性多糖，存在于紫菜细胞壁中。紫菜多糖营养丰富，不仅具有一般多糖和膳食纤维所具有的生理功能，而且还具有抗凝血、降血脂、抗突变、抗衰老和抗放射等多种生物活性。由于紫菜中还含有大量的紫菜蛋白，与紫菜多糖相互结合，影响紫菜多糖的分离，为此，研究紫菜中紫菜多糖的提取、分离、纯化方法对后续研究其生物活性具有重要意义。

目前，从紫菜中提取紫菜多糖多采用化学提取法，存在提取时间长、溶剂消耗量大、提取得率较低、安全性不高等问题。公开号为CN1872882A的发明专利申请公开了一种制备紫菜多糖的方法，紫菜经打碎、乙醇回流、超声波破碎、水浴抽提、浓缩、有机溶剂提取、脱色、冷藏、冷冻真空干燥，获得紫菜多糖。该法较大程度地保持了紫菜多糖的活性，紫菜多糖得率较高，色素含量低，但该法仍采用多种化学试剂来提取紫菜多糖，步骤多，操作繁琐，提取条件复杂，安全性低。

要从紫菜中充分地获得紫菜多糖，应当尽可能地破坏紫菜细胞结构，部分降解聚半乳糖醛酸硫酸酯使其可溶于水中。酶解法相比化学提取法具有操作简单、条件温和、容易控制、安全可靠等特点，目前广泛应用于活性物质的提取和制备，但单纯采用酶法提取反应速度较慢，反应时间较长。超声波处理破碎细胞也是目前天然产物提取、活性物质制备中常用的方法，但较大功率、较长时间的超声波处理容易引起活性物质的失活；另一方面，单纯用超声波处理，紫菜细胞壁的多聚半乳糖醛酸硫酸酯基本保持完整，仅产生少量空隙，影响紫菜细胞破碎效率，而且分子量过大的聚半乳糖醛酸硫酸酯不溶于水，且与紫菜细胞碎片结合在一起难以分离。采用酶解法协同超声波破碎从紫菜中提取紫菜多糖还研究较少。

酵母细胞表面展示表达系统是一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，具有糖基化作用、蛋白翻译后折叠和与哺乳动物类似的分泌机制的优势，相比噬菌体和大肠杆菌细胞表面展示技术，更有利于高效表达具有生物活性的复杂蛋白。研究表明，多种酶类包括生物素连接酶、有机磷水解酶等都被成功展示在酵母细胞表面，且酶活相比野生型酶均有不同程度的提高。毕赤酵母表达系统作为一种新的展示蛋白系统，具有易于培养、繁殖快、可调控外源基因的表达等特性，相关研究近年发展迅速，成为酵母表面展示系统中极具应用前景的宿主菌。

发明内容

本发明提供了一种酵母展示型聚半乳糖醛酸酶协同超声波处理提取紫菜多糖的方法，以紫菜为原料，利用毕赤酵母表面展示聚半乳糖醛酸酶，再通过酶解协同超声波处理破碎紫菜细胞，可高得率地获得较高纯度的紫菜多糖。

一种酵母展示型聚半乳糖醛酸酶协同超声波处理提取紫菜多糖的方法，包括：

将紫菜干粉、酵母展示型聚半乳糖醛酸酶加入水中混匀，于35～37℃搅拌反应30～45分钟，再于28～35℃利用功率为730～750W的超声波破碎1～2小时，得到细胞破碎液，分离纯化制得紫菜多糖。

所述的紫菜干粉的粒径优选为60～100目。

优选地，以每克紫菜干粉计，所述的酵母展示型聚半乳糖醛酸酶的加入量为0.05～0.08g；更优选地，以每升水计，所述的紫菜干粉的加入量为20～25g，所述的酵母展示型聚半乳糖醛酸酶的加入量为1～2g。

优选地，所述的搅拌速率为100～200转/分钟。通过搅拌，可促进酵母展示型聚半乳糖醛酸酶与紫菜细胞之间的相互作用，提高酵母展示型聚半乳糖醛酸酶对紫菜细胞壁的酶解效率。

通过所述的超声波处理促进紫菜细胞的破碎，更有利于酵母展示型聚半乳糖醛酸酶对紫菜细胞壁的降解作用。超声波作为一种物理能，一方面，能通过空化作用产生极大的压力，造成被破碎物的细胞壁甚至整个生物体破裂而使胞内物质释放、扩散或溶解出来；另一方面，适宜强度的超声波能够使酶分子的构象发生正向转化，从而提高酶的活性，加速酶解反应。

由于超声波频率高、能量大，作用过程中会产生显著的热效应，为了降低热效应对酵母展示型聚半乳糖醛酸酶酶活的影响，所述的超声波的处理温度为28～35℃，超声波的功率为730～750W。

所述的分离纯化包括：对细胞破碎液进行离心处理，取上清液，上清液经盐析、去沉淀后得到紫菜多糖。