[发明专利]免疫毒素的表达和纯化方法

权利要求书

1.一种在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达免疫毒素的方法，包括：

a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养可表达免疫毒素的巴斯德毕赤酵母；

b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中甲醇诱导的温度在约17.5℃以下。

2.根据权利要求1的方法，其中所述甲醇诱导是添加0.5至0.75ml/min(每10L初始培养基)的限量甲醇。

3.根据权利要求1的方法，其中所述甲醇诱导是含甲醇和甘油的补料。

4.根据权利要求3的方法，其中在所述含甲醇和甘油的补料中，甲醇和甘油比例约为4∶1。

5.根据权利要求1的方法，其中所述免疫毒素为融合蛋白。

6.根据权利要求1的方法，其中所述免疫毒素包括白喉毒素部分。

7.根据权利要求6的方法，其中所述白喉毒素部分为截短型。

8.根据权利要求7的方法，进一步包括CD3抗体部分。

9.根据权利要求8的方法，其中所述免疫毒素包括A-dmDT390-bisFv(G₄S)。

10.根据权利要求1的方法，其中所述巴斯德毕赤酵母包括在编码EF-2的氨基酸序列中具有突变。

11.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白的酶消化产物是大豆蛋白的酶消化产物。

12.根据权利要求1的方法，进一步包括将巴斯德毕赤酵母与苯甲烷磺酰氟和氨基酸源相接触。

13.根据权利要求12的方法，其中将巴斯德毕赤酵母与苯甲烷磺酰氟和氨基酸源相接触至少2小时。

14.根据权利要求12的方法，其中苯甲烷磺酰氟溶于4∶1甲醇甘油诱导补料中，浓度不超过10mM。

15.根据权利要求12的方法，其中所述氨基酸源为酵母提取物。

16.根据权利要求1的方法，其中所述温度选自：17.5、17.0、16.5、16.0、15.5、15.0、14.5、14.0、13.5、13.0、12.5和12.0℃。

17.根据权利要求1的方法，其中所述温度约为15℃。

18.根据权利要求1的方法，其中所述生长培养基的组成为约4％甘油，约2％酵母提取物，约2％大豆蛋白的酶消化产物，约1.34％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮源，以及约0.43％PTM1溶液。

19.根据权利要求18的方法，其中所述生长培养基进一步包括消泡剂。

20.根据权利要求19的方法，其中所述消泡剂的浓度为约0.01％或更高。

21.根据权利要求20的方法，其中所述生长培养基的组成为约4％甘油，约2％酵母提取物，约2％大豆蛋白的酶消化产物，约1.34％含有硫酸铵不含氨基酸的酵母氮源，约0.43％PTM1溶液以及约0.02％消泡剂。

22.根据权利要求1的方法，其中在生长培养基中溶解氧的浓度保持在40％的数值或更高。

23.根据权利要求1的方法，其中生长步骤的pH值约为3.5，甲醇诱导步骤的pH值约为7.0。

24.根据权利要求1的方法，其中甲醇诱导步骤进行约22至288小时之间。

25.一种在巴斯德毕赤酵母中表达免疫毒素的方法，包括：

a)在包含蛋白的酶消化产物和酵母提取物的生长培养基中培养可表达免疫毒素的巴斯德毕赤酵母；

b)对巴斯德毕赤酵母进行甲醇诱导，其中所述甲醇诱导包括添加0.5-0.75ml/min/10L初始体积的限量甲醇，其中诱导进行的温度在17.5℃以下，补充消泡剂至0.07％，搅拌速度保持在400RPM，且其中诱导步骤进行约22至288小时之间。