[发明专利]DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法

权利要求书

1.一种鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的引物，其特征在于：所述引物序列如下：

5’-GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3’

5’-TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3’。

2.一种利用DNA分子标记鉴别技术鉴别头花蓼与尼泊尔蓼的方法，其特征在于：操作步骤如下：

1)合成特异性鉴别引物：

按序列5’-GCTCGGTTTCAGAATAAGT-3’，5’-TCCCTGAGGTGTTCGTTT-3’合成一对特异性鉴别引物；

2)以改良CTAB法分别提取头花蓼DNA基因、尼泊尔蓼DNA基因；

3)以步骤2)所得的头花蓼DNA基因和尼泊尔蓼DNA基因为模板，进行PCR扩增；

4)检测PCR反应结果。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述以改良CTAB法分别提取头花蓼DNA基因、尼泊尔蓼DNA基因的步骤如下：

①取头花蓼、尼泊尔蓼药材各50mg，放入已消毒的2个研钵中，分别加入CTAB提取液约2400μL，分别迅速研磨，在研磨的过程中加入20μL β-巯基乙醇，研磨至粉末糊状；

②用镊子取离心管放在离心板上，编号，待用；

③分别用移液枪将研磨好的药材提取液吸取700μL至离心管中；离心管插于漂浮板上，60℃水浴加热60min，每10min振摇一次；

④取出离心管，分别加入700μL氯仿∶异戊醇＝24∶1的混合溶液，充分混匀，室温下12,000rpm离心10min；

⑤将离心管的上层水相转入一新离心管中，分别加入700μL CTAB沉淀缓冲液，混匀，室温下静置2h；

⑥室温下12,000rpm离心10min，弃废液；

⑦向离心管中加入700μL70％的乙醇，室温下12,000rpm离心5min，弃废液；

⑧再加入700μL 95％的乙醇，室温下12,000rpm离心5min，弃废液；

⑨敞开离心管口，在室温下放置5h，挥干乙醇，得到所提取的药材总DNA；

⑩装有药材DNA的离心管中于-20℃贮存备用。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述PCR扩增反应体系为：

分别取4支50μL的PCR反应管，建立头花蓼药材、尼泊尔蓼药材、阴性对照1、阴性对照2的PCR扩增反应体系：

①头花蓼PCR反应管中加入以下成分：头花蓼DNA模板1μL，10mmol·L^-1的dNTPmix13μL，一对10pmol·L^-1的高度特异性鉴别引物各1μL，加入双蒸水补齐至25μL；

②尼泊尔蓼PCR反应管中加入以下成分：尼泊尔蓼DNA模板1μL，10mmol·L^-1的dNTPmix 13μL，一对10pmol·L^-1的高度特异性鉴别引物各1μL，加入双蒸水补齐至25μL；

③阴性对照1的PCR反应管中加入以下成分：头花蓼DNA模板1μL，10mmol·L^-1的dNTPmix 13μL，加入双蒸水补齐至25μL；

④阴性对照2的PCR反应管中加入以下成分：10mmol·L^-1的dNTPmix 13μL，一对10pmol·L^-1的高度特异性鉴别引物各1μL，加入双蒸水补齐至25μL。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，51℃退火45s，72℃延伸2min，循环40次；72℃后延伸7min，4℃保存。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤4)中，所述检测PCR反应结果的步骤为：分别自4支PCR反应管中取5μL反应液加入1μL溴酚蓝溶液染色后，再将染色液加入1.0％琼脂糖凝胶梳孔，在TE缓冲液中电泳1h，取出，在紫外凝胶成像系统下拍照观察；结果在琼脂糖凝胶上，头花蓼药材在与Mark 300bp相对应位置，可见一条明亮的电泳带，而尼泊尔蓼药材在相同位置无任何条带出现。