[发明专利]一种农杆菌转化大豆的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体说是一种农杆菌介导转化大豆子叶节的方法。

背景技术

早在1988年由Hinchee第1个以农杆菌介导法获得大豆转基因植株，农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化仍然是目前应用最广泛的一种转基因技术，这种方法有很多优点：获得再生植株的时间短、不可育的再生植株少、外植体来源不受时间限制；具有操作简单、费用低廉、可插入基因片段大、不容易发生重排、拷贝数低且符合孟德尔遗传规律等优点(Meurer et a.l,1998;林树柱等,2004,刘海坤2005)。但是也存在一些实际问题，如子叶节细胞的转化效率低，再生转化细胞和再生芽的无效选择，重复性很差，植株再生困难等仍然是该系统实施的瓶颈（Olhoft和Somers2001等；林树柱2004；姬月梅2009）。（Biotechnolog. 1988, 6: 915-922；Plant Cell Report, 1998.18:180-186；植物生理与分子生物学报, 2005,31(2): 126-134； Pla Cell Rep.,2001,20:706-711；生物工程学报,2004,20(6): 817-820；农业科学研究,2009,1: 47-49）。

在已公开的植物转基因技术中，农杆菌介导大豆子叶节遗传转化获得转基因大豆植株经过以下步骤：大豆无菌苗的培养，子叶节制备，农杆菌侵染与共培养，不定芽诱导筛选培养，不定芽生根，植株移栽，转化苗开花结荚获得种子。自1988年Hinchee等首次报告农杆菌转化大豆成功，之后的研究很多都沿用了这种方法，但是农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化效率至今仍没有取得很大突破，原因是大豆转基因的实际操作是一个较复杂的过程，每一个操作步骤都会对最终的转化效率有影响，甚至起决定作用。在农杆菌介导大豆子叶节遗传转化操作过程中，侵染和共培养这两个步骤是农杆菌粘附在外植体表面和外源基因进入植物细胞及整合到植物基因组的过程，因此对转化率起决定作用。这两个步骤要求合适的侵染时间、侵染液浓度、共培养的时间、温度和合适的共培养基成分及其pH值等。子叶节系统目前通常采用的侵染时间一般在10-30min，侵染农杆菌液浓度在OD600=0.3-1.0；目前通常采用的共培养基的pH为5.4，共培养条件是温度为22-24℃、完全黑暗，共培养时间为3d，转化效率一般在3%以下，而且不稳定。Chen认为大豆的转化率一般为 0.5 %～1.8 %，李明春等报道的转化率为 1.27 %,崔欣的转化率为0.49 %～0.91 %,段莹莹的子叶节转化法转化率为 1.86%，吕慧颖研究表明 ,转化率为2.39 % , 姬丹丹转化率为2.2-2.5%（Plant Cell Tissue Organ Cult., 2007, 89: 177-183；Acata Botan Sinc，2004 ,46 (5) :610-617；农 业 科 学 研 究，2009，30（1）:47-49；分子生物学报, 2007, 40(5): 286-294；大豆科学, 2010，29 (1): 8-12；山东大学学 报(理学版 ) 2011，46（5）117-121，）。研究者们相继在 ① 大豆基因型; ② 农杆菌菌株和Ti 质粒; ③ 外植体类型; ④共培养基中酚类化合物和抗氧化剂种类及转化时合适的筛选剂等各种技术性环节进行了探索，每个试验研究的转化效率都有所提高（农业科学研究,2009,1: 47-49）。

另外，共培养基的pH是遗传转化效率最直接的影响因素。农杆菌和外植体大豆子叶节均与培养基直接接触，农杆菌的生长及T-DNA向植物细胞转移的活性均受环境pH影响，农杆菌生长的适宜pH为6-9，因此给农杆菌创造一个合适的环境很重要，目前通用的pH为5.4。武小霞等研究结果显示，大豆遗传转化共培养基的pH在5.2-5.6范围内为宜，不定芽诱导率最高；赵晓雯认为pH 值是影响遗传转化效率的最主要因素,最适宜 pH为5.2，PCR 阳性率1.06-5%，平均为2.27%（东北农业大学学报, 2010, 41(5): 1-4；大豆科学，2011. 30（3）:362-368）。