[发明专利]中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法

说明书

技术领域  本发明是一种中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法。

背景技术  中国地生兰花种子极细，细如尘埃，种子内仅有一个发育不完全的胚，没有胚芽和胚乳，不具备种子的基本结构，没有供其萌发的营养物质，还不能称其为种子，只能称其为原生细胞胚，加之有一层翅羽状种皮，种皮不易吸收水分，如莲瓣兰种子泡在水中三年以上也不能吸收到水分和外部提供的营养物质，在自然界中必须靠某种真菌菌丝穿透其种皮为其提供营养才能诱发根状茎龙根，不同的兰花所需的真菌各不相同，人们至今未能分离到能作用于中国兰花的真菌，各科研机构经过多年研究，仅仅分离到可供腐生兰天麻萌发的小菇真菌，和供其生长所需的密环菌。所以，人工繁殖天麻得以成功，其他兰花还不能自然繁殖。用常规方法播种不能萌发，故需要人工突破种皮后再由培养基来供给养份才能使原生细胞胚萌发，突破种皮现有技术是用氢氧化钠溶液或酸溶液来浸泡腐蚀种皮，破皮后氢氧化钠溶液或酸溶液同时也腐蚀了细胞胚，使其失活，难以控制得恰到好处，成功率极低，在加上中国地生兰花不能诱导产生原球茎，而是在未知真菌作用下偶然产生根状茎龙根，龙根在底下潜伏生长多年后形成龙根蛋或龙根球后，才分化出兰花实生苗，人工诱导根状茎龙根目前是个技术难题，此技术以前一直以日本、台湾领先，经数十年研究，国内外有个别成功启动的报道但很难实现重复成功启动，再加上启动根状茎龙根成功率极低，一直以来未能达到批量生产目的，洋兰(如大花蕙兰和蝴蝶兰)不产生根状茎，直接由茎尖组织或种子产生原球茎，即可分化出从生芽，培养比较简单所以日本、台湾早已实现产业化生产，出口至世界各地赚取了大量外汇，而幽香高洁、号称“王者之香”的中国地生兰花至今不能产业化生产，因此在物以稀为贵的原因下，前几年有人将国兰炒到了几十万、甚至几百万一苗的天价，损害兰花爱好者的利益。本发明旨在突破国兰产业化的技术瓶颈，并取得了成功。

发明内容  本发明的目的是提出一种中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，该方法能够有效破解中国地生兰花果实中细胞胚的种皮，同时又不损伤细胞胚本身，使细胞胚能吸收到周围营养和水分，细胞能分化发育成种苗，并且有高的细胞胚启动率，以此解决现有技术的难题。

本发明提出的这种中国地生兰花原生细胞胚消化酶干预培养法，其特征在于它有如下步骤：

(1)蜗牛酶消化酶的提取：从田间收集活的大蜗牛，饥饿两天后用水冲洗干净，轻轻敲碎，并小心剥去外壳，顺消化道剪开体壁，剥离出消化道，从嗉囊和胃里抽取棕色消化液，用离心机以离心分层后，留上清液，弃掉沉淀物，用无菌滤膜注射器过滤纯净上清液待用；

(2)细胞胚预处理：选用尚未开裂的兰花果实，表面用75％的酒精灭菌后，用10％次氯酸钠浸泡5～10分钟，用无菌水冲洗3次完成表面消毒后，在无菌操作台上切开果子，将其中的原生细胞胚粉粒倒入置于100毫升消化酶溶液中25℃度浸泡30-50分钟，用滴管吸取少量含有细胞胚粉粒的液体在相差显微镜下观察，在显微镜下观察到翅羽状种皮开始降解时，立即停止浸泡并用无菌水冲洗至少3次，用滤纸过滤原生细胞胚粉粒；

(3)稀释：将过滤出的细胞胚粉粒放入启动有丝分离液体营养液中稀释；

(4)接种：将第(3)步含有细胞胚粉粒的液体培养液接种于试管中的基础固体营养基上；

(5)暗培养：接种好的试管在25℃恒温状态下在旋转床上震荡暗培养，直到可观察到细胞胚粉粒开始膨大，细胞胚有丝分离开始；

(6)光照培养：此时转为在1300LX光强下每天照射12h光照培养，恒温25℃条件下静置培养，直到可观察到白色细胞团膨大至1-3mm，颜色转绿，在下部长出白色生长点1-6个，逐渐向下钻入固体营养基，此时已完成了试管内兰花根状茎(又名“龙根”)启动过程；

(7)分化：将根状茎转接于分化固体营养基中生长点朝下插入营养基，25℃光强2000LX条件下，培养60d左右生长点开始不断向下生长至2-3cm，根状茎开始转向折头向上生长，直至钻出固体营养基表面，这时生长点分化为芽点并长出子叶；

(8)生根：将根状茎转接于壮苗生根固体营养基上，芽点朝上根状茎朝下，25℃光强2500LX条件下培养60d，根状茎与子叶交界处长出肉质气生兰根，子叶中心长出完整兰花苗；

(9)炼苗移栽：将兰花苗连龙根一起从试管中移出，洗净根部附着的营养基，用1/1000浓度的多菌灵消毒后，晾干至气生根发白时，移栽至经高温消毒的腐质基质中。

第(1)步的消化酶上清液，现取现用，间隔不超过一天，以保持其活性。