[发明专利]一种基于假attP位点整合的通用型表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，包括attB序列、pUC ori和多克隆位点MCS，CMV组成型启动子与attB序列相连接，CMV组成型启动子下游插入两个同向的LoxP元件，在LoxP元件下游设有第一荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子，在两个LoxP元件之间设有第二荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子和抗生素筛选元件。

2.如权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，所述的attB序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的CMV组成型启动子为Pcmv IE启动子。

3.如权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，所述的多克隆位点MCS包括以下限制性内切酶识别位点：

MluI、BamHI、PacI、PspOMI、SacI、FseI、AclI、XhoI、PvuI、KpnI、HindIII、BglII和EcoRI。

4.如权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，所述的两个同向的LoxP元件及其内外侧酶切识别位点的序列如SEQ.ID.NO.2所示。

5.如权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，所述的第一荧光指示蛋白开放阅读框为绿色荧光蛋白eGFP开放阅读框，第二荧光指示蛋白开放阅读框为红色荧光蛋白DsRed开放阅读框，其终止子均为Sv40终止子。

6.如权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体，其特征在于，所述的抗生素筛选元件为KanR/neoR表达元件，两个LoxP元件之间以还设有一个阻止CMV组成型启动子对第一荧光指示蛋白泄漏表达的Sv40终止子。

7.一种基于假attP位点整合的通用型表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.1所示的两端含有AseI酶切位点及保护碱基的attB序列；

2)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.2所示的两个同向的LoxP元件及其内外侧酶切识别位点的LoxP2序列；

3)通过SOE-PCR方法，克隆获得如SEQ.ID.NO.3所示的包含多个克隆位点的MCS序列；

4)用BamHI/BglII双酶切pEGFP-C1载体，凝胶回收载体骨架片段并连接后，获得pEGFP-B2载体；

通过AseI酶切位点将attB序列克隆入pEGFP-B2载体获得pAttB-eGFP载体；

通过NheI/AgeI酶切位点将LoxP2序列克隆入pAttB-eGFP载体获得pAttB-Loxp2-eGFP载体；

5)通过SpeI/AflII酶切位点，将包含KanR/neoR基因开放阅读框、表达KanR基因的原核启动子、表达neoR基因的SV40早期启动子及HSV TKpolyA终止子的KanR/neoR表达元件，克隆入pAttB-Loxp2-eGFP载体中得到pAL2G-neo载体；

然后再通过AflII/NotI酶切位点将Sv40pA终止子克隆入pAL2G-neo载体，得到pAL2G-neopA载体；

6)用MluI/EcoO109I分别双酶切MCS序列和pAL2G-neopA载体，凝胶回收酶切后的片段，然后将回收的片段连接后得到pANG-MCS载体；

7)通过AscI/SpeI酶切位点将DsRed1开放阅读框及其终止子序列克隆入pANG-MCS载体，得到基于假attP位点整合的通用型表达载体pARNG。

8.权利要求1所述的基于假attP位点整合的通用型表达载体在筛选稳定表达荧光标记蛋白的无抗生素筛选标记的重组细胞的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，基于假attP位点整合的通用型表达载体在进行细胞转染之后，进行药物筛选，获得表达载体稳定转染的重组细胞；然后对其进行Cre重组剪切LoxP序列的处理，筛选稳定表达第一荧光蛋白的重组细胞，获得表达荧光标记蛋白的无抗生素筛选标记的重组细胞。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的Cre重组剪切LoxP序列的处理为：

对药物筛选后的重组细胞进行包含Cre元件的表达载体的转染，或者将其在含有连接有穿膜肽的Cre重组酶的环境中进行孵育。