[发明专利]人免疫系统毒性蛋白颗粒酶H特异性抑制剂、制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的人免疫系统毒性蛋白颗粒酶H抑制剂、它的制备方法以及用途。

背景技术

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)在机体进行抗病毒及细胞内细菌感染、器官移植排斥和抗肿瘤应答中具有重要作用。死亡受体途径(FAS/FASL)以及释放细胞毒性颗粒是这两类杀伤细胞导致靶细胞凋亡及清除的重要通路，而后者是最重要且最有效的杀伤武器。细胞毒性颗粒内主要含有打孔蛋白穿孔素(perforin)和颗粒酶(granzymes)。颗粒酶是一类高度保守的丝氨酸蛋白酶家族成员，具有经典的丝氨酸蛋白酶折叠构象及催化三联体结构。在人类中目前一共发现5种颗粒酶(A、B、K、H和M)。颗粒酶H的基因定位于14q11.2，在颗粒酶B以及组织蛋白酶G(cathepsin G)基因簇之间。尽管从基因进化上分析，颗粒酶H基因部分被颗粒酶B所取代，两者之间有着71％的氨基酸序列同源性，颗粒酶H却具有完全不同于颗粒酶B的酶学特性。颗粒酶H仅在疏水性芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸后特异性水解底物。功能上，颗粒酶H一方面通过切割ICAD(人凋亡蛋白酶激活因子1)，Bid等底物导致细胞凋亡；另一方面通过水解宿主自身抗原蛋白La，可抑制La介导的HCV(Hepatitis virus C)的转录复制。更重要的是，颗粒酶H通过直接切割腺病毒蛋白组装蛋白100K和DNA结合蛋白，解除100K对颗粒酶B的抑制，并且有效抑制腺病毒的组装和复制。鉴于颗粒酶H唯一高表达于NK细胞中，其表达量不受NK细胞活化状态的影响，关于颗粒酶H的研究证明其中天然免疫过程中的独特作用。根据颗粒酶H的特殊结构，设计颗粒酶H特异性的抑制剂，可在相关领域的科学研究，及临床抑制器官移植排斥反应和自身免疫性疾病的治疗中发挥重要的作用。

发明内容

本发明在人颗粒酶H结构与功能的解析基础上，设计合成了一种人颗粒酶H特异性的抑制剂，其化学结构式如下：

其中Pro、Thr、Ser、Tyr分别代指脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸四种氨基酸，ACE表示乙酰基，CMK表示氯甲基酮。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.式(I)的化合物：

其中Pro、Thr、Ser、Tyr分别代指脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸，ACE表示乙酰基，CMK表示氯甲基酮。

2.以上1所述的化合物，其特征在于：多肽组成以及它们的相对结构位置为Pro-Thr-Ser-Tyr；ACE表示乙酰基；CMK表示氯甲基酮。

3.以上1或2所述的式(I)的化合物，其是人免疫系统毒性蛋白颗粒酶H结合口袋识别多肽序列。

4.以上3所述的式(I)的化合物，其中Tyr-CMK与人免疫系统毒性蛋白颗粒酶H的结合口袋之间形成的共价键。

5.式(I)的化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)根据化学式(I)的化合物的氨基酸组成及其相对位置，合成肽段；

(2)对步骤(1)中合成肽段的N端进行乙酰化修饰；和

(3)对步骤(2)中修饰完成的肽段进行C端CMK修饰。

6.以上5所述的制备方法，进一步包括：分离纯化和通过质谱法鉴定所得肽段。

7.以上1或2所述的式(I)的化合物在制备人免疫系统毒性蛋白颗粒酶H抑制剂中的用途。

8.以上7所述的用途，其中所述抑制剂用于减少器官移植排斥、治疗自身免疫病和/或治疗肿瘤。

在本发明中，发明人根据颗粒酶H的特殊结构(结晶结构)从头设计一种颗粒酶H特异性的新抑制剂。本申请的发明人解析并鉴定人颗粒酶H的晶体结构，然后基于解析出来的晶体结构理性设计和验证了本申请要求保护的人颗粒酶H特异性抑制剂化合物。在本发明中，CMK不仅仅是起一种肽末端保护基的作用，其在本发明的肽抑制剂与颗粒酶H的结合中也发挥重要作用。如本申请说明书附图2所示，Tyr-CMK与颗粒酶H的结合口袋之间形成的共价键，从而有效地将该抑制剂锁定在该酶内。