[发明专利]一种与药源性肝损伤相关的微小核糖核酸标志物及其检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术和制药技术领域，涉及一种与药源性肝损伤相关的血清/血浆微小核糖核酸标志物及其检测试剂盒在药源性肝损伤的早期检测，以及在药物肝脏毒性安全性评价方面的应用。

背景技术

随着各种新药的广泛应用以及联合用药的增多，药源性肝损伤(Drug-induced Liver Injury，DILI)已成了医疗卫生工作者、制药工业和药品管理部门共同面对的重要问题。据报道，药源性肝损害占药物不良反应10％-15％，临床上实际发生的药源性肝损伤的案例远较报道数要多。DILI是药物从市场上撤回的最常见的原因。在过去的数年，由于具有较高的肝损伤发病率和死亡率，美国食品与药品管理局已经从市场上撤回了较多药物，包括：溴芬酸、乙溴替丁、曲格列酮等，其他诸如氟烷、氯丙嗪、他克林等药物均因为肝毒性而限制了其治疗应用。近年来，中草药引发的肝损伤问题也受到越来越多的关注。临床上报道的引发DILI的中草药有黄药子、雷公藤、千里光、复方制剂有壮骨关节丸、疳积散、小柴胡汤等。

目前临床上以及实验室研究中所应用的药源性肝损伤诊断指标为肝功能相关血液生物化学指标。主要有谷丙转氨酶(Alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase，AST)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、总胆红素(Total bilirubin，TBIL)、直接胆红素(Direct bilirubin，DBIL)、间接胆红素(Indirect bilirubin，IBIL)、胆汁酸(Total bile acid，TBA)等指标。然而即便是作为临床诊断肝损伤金标准的血清ALT和/或AST也不能满足药源性肝损伤诊断的需要，其主要原因有三方面：首先，存在检测特异性的问题：血清AST活性的增高与心肌和骨骼肌损伤相关；同时血清ALT活性也和肌肉坏死存在联系。所以容易导致检测值出现误差。其次，包括ALT和AST在内的这一系列血液生物化学指标对检测样本的保存要求较高，因为它们多为具有活性的蛋白质，临床样本保存条件不当或者保存时间过长常导致这些蛋白质活性的丧失，检测值也会随之下降。最后，临床诊断中，在观测血清ALT和/或AST值的同时还会参考上述其他指标，但其他指标的敏感性和特异性远远达不到作为中药药源性肝损伤早期诊断标志物的要求。所以，优于或等同于血清ALT和/或AST值诊断价值的标志物亟待开发。寻找在药源性肝损伤早期诊断方面有指示作用的，同时能够弥补现有标志物缺陷的新型分子标志物的研究和开发工作一直在不懈的探索中，目前已发现的新型分子标志物的代表有：苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase，MDH)，嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorlyase，PNP)，对氧磷酶1(Paraoxonase-1，PON1)等。然而，它们和临床中正在使用的标志物一样，都是容易失去活性的蛋白质，而且它们的检测敏感性和特异性还有待进一步考证，进而限制了其临床上的开发应用。

近年来，作为新的研究切入点，microRNA为癌症的诊断与治疗开辟了一条新途径。microRNA，简称miRNA，是一类由动物、植物和病毒基因组所编码的长约19-23个核苷酸的小分子单链RNA，它们不具有开放阅读框，不编码蛋白质，但却参与机体的各种重要的生理和病理过程。miRNA广泛存在于血清、血浆、唾液、痰、尿液、乳汁、羊水、精液、胸腹水、脑脊液、汗液等各种各样的体液中，其特异性的表达谱可以作为识别多种疾病的生物标志物，应用前景广阔。而所有这些标志物之中，最引人瞩目的、应用潜力最大的自然是血清/血浆miRNA在癌症的诊断中的应用。血清/血浆miRNA作为肿瘤标志物的优越性在于：(1)已有的对正常人和不同癌症病人的血清/血浆miRNA的检测结果表明，miRNA分子广泛存在于正常人和不同癌症病人的血清/血浆中，并且随着生理状况、肿瘤的种类和病程的不同，miRNA分子在血清/血浆中存在的种类和数量将发生显著变化，该结果提示血清/血浆miRNA作为癌症诊断和预后的标志物具有灵敏度高、特异性好的特点，可改进癌症诊断、分类、预后估计、疗效预测的精度；(2)血清/血浆miRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，而且定量精确，该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的改进，将为癌症的防治开创全新局面；