[发明专利]用于H9亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组、检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及禽流感病毒的检测方法，尤其涉及基于RT-LAMP设计的检测H9亚型禽流感病毒的引物组，及其检测方法和应用，属于禽流感病毒的检测领域。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)为单股负链RNA，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，H9N2亚型为中低致病力毒株，其特点是分布广泛，能造成宿主的免疫抑制，并且可与其它病原微生物通过协同作用引起禽类发病。

H9N2虽然为中等低致病力毒株，但它对养禽业的危害同样不容忽视，1996-2000年间，我国H9N2亚型禽流感的发病率占总禽流感发病率的93.89％，成为影响我国养禽业的主要AIV亚型。自1994年在我国广东某鸡场首次分离到H9N2亚型禽流感病毒以来，H9N2亚型禽流感在我国一直呈上升趋势，国际范围内也广泛发生。我国学者先后从不同地区不同宿主体内分离到了相同亚型的禽流感病毒。特别是1999年以来H9N2亚型禽流感病毒感染人事件的多次发生，严重威胁人类健康、畜牧业生产和畜产品国际贸易，尤其是公共卫生意义引起了全世界的广泛关注，对该亚型病毒的研究也取得了较快的进展。

由于H9亚型禽流感病毒引起的轻微呼吸道症状，产蛋鸡产蛋量下降等和新城疫、传染性喉气管炎、传染性支气管炎等禽类疾病极为相似，在临床上较难区分。为了在疫情出现后能够快速及时地作出反应，建立一种方便快捷的H9亚型禽流感病毒的检测方法具有重要的意义。禽流感的检测方法有病毒分离、血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验、IFA、ELISA、RT-PCR、Real-time、PCR、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)和微阵列芯片(Microarray)等，RT-PCR技术是研究的热点之一。

快速诊断和及时监测是禽流感防控的首要步骤和重要一环。目前，有关禽流感的检测方法较多，经典的流感病毒病原学诊断方法中病毒分离及其生物学特性的研究是最为可行和最能说明问题的，但病毒的分离鉴定需要将病料接种鸡胚或组织培养，需要较长的时间(几天到一周)，不能够满足急性烈性传染病紧急疫情防制工作的需要，同时由于高致病性禽流感病毒存在感染哺乳动物的潜在危险，病毒的操作需要在生物安全三级实验室进行，一般检疫部门不具备这种试验条件。快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术，如RT-PCR，RT-PCR-ELISA，real-time RT-PCR已经在禽流感病毒检测中发挥着重要作用(Shan，2003；Collins，2002；Wang，2005；Spackman，2003；Poddar，2002)。但都需要复杂的检测仪器(如PCR仪，荧光定量PCR仪等)，在一些基层的实验室操作时受到限制。环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification Method，LAMP)技术是一种新的体外扩增特异性DNA片段的分子生物学方法(Notomi，2000)。该方法不需要额外的反转录步骤，只需要简单的水浴锅，在30-90min内即可扩增大量的核酸，不需要通过核酸电泳的方法来检测结果，只需通过其副产物-白色的焦磷酸镁沉淀来观察结果(如果加入荧光染料后会更易观察)。LAMP所具有的简单、快速、高效、实用的特点，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。该方法已经成功地应用于H9和H9亚型AIV的检测。建立一种能够灵敏、特异的H9亚型AI V的RT-LAMP检测方法的前提是需要针对H9HA基因保守区设计得到特异性引物。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种能够灵敏、特异的检测H9亚型禽流感病毒RT-LAMP的引物组；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于H9亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对序列分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

本发明还提供一种检测H9亚型禽流感病毒的方法，其特征在于：使用所述的引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增。

本发明的所述的RT-LAMP引物组可用于制备检测或诊断H9亚型禽流感病毒的生物试剂。