[发明专利]用于H5亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组、检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及禽流感病毒的检测方法，尤其涉及基于RT-LAMP设计的检测H5亚型禽流感病毒的引物组，及其检测方法和应用，属于禽流感病毒的检测领域。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)为单股负链RNA，是正粘病毒科流感病毒属成员，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的囊膜糖蛋白-血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为16个HA亚型和9个NA亚型。不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza，HPAI)可引起鸡群100％死亡，被国际兽疫局确定为A类传染病。在1959-1998年的40年间，世界范围内一共报道了17次高致病性禽流感(HPAI)。近年在全球时见报导的主要是H5N1和H7N1两个亚型，其中倍受关注的是H5N1。近几年来发生的高致病力禽流感疫情是由H5亚型AIV引起的有：1983～1984年美国发生H5N2亚型引起的禽流感流行，病死率近90％，死亡和扑杀家禽1700万只；1997年香港发生H5N1亚型禽流感流行，宰杀了家禽150万只。2003～2004年东南亚的H5N1亚型禽流感暴发，韩国、日本、台湾、越南、泰国等10多个国家和地区，我国内地广西、湖北、安徽等多个省市的某些乡镇发生H5N1亚型引发的禽流感疫情，病死与宰杀的家禽已逾5000万只。尤其是1997年以来已有人类感染禽流感并致死的报道，最近，世界卫生组织最近再次确认全球已确诊153例人感染禽流感83人死亡，造成世界对H5N1的一片恐慌。因此，为了对疫情快速采取应对措施，对疑似病例做出快速有效的诊断有重要意义。目前对AIV进行快速检测的方法有IFA、ELISA、RT-PCR、Real-time RT-PCR、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)和Microarray等。

快速诊断和及时监测是禽流感防控的首要步骤和重要一环。目前，有关禽流感的检测方法较多，经典的流感病毒病原学诊断方法中病毒分离及其生物学特性的研究是最为可行和最能说明问题的，但病毒的分离鉴定需要将病料接种鸡胚或组织培养，需要较长的时间(几天到一周)，不能够满足急性烈性传染病紧急疫情防制工作的需要，同时由于高致病性禽流感病毒存在感染哺乳动物的潜在危险，病毒的操作需要在生物安全三级实验室进行，一般检疫部门不具备这种试验条件。快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术，如RT-PCR，RT-PCR-ELISA，real-time RT-PCR已经在禽流感病毒检测中发挥着重要作用(Shan，2003；Collins，2002；Wang，2005；Spackman，2003；Poddar，2002)。但都需要复杂的检测仪器(如PCR仪，荧光定量PCR仪等)，在一些基层的实验室操作时受到限制。环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification Method，LAMP)技术是一种新的体外扩增特异性DNA片段的分子生物学方法(Notomi，2000)。该方法不需要额外的反转录步骤，只需要简单的水浴锅，在30-90min内即可扩增大量的核酸，不需要通过核酸电泳的方法来检测结果，只需通过其副产物-白色的焦磷酸镁沉淀来观察结果(如果加入荧光染料后会更易观察)。LAMP所具有的简单、快速、高效、实用的特点，非常适合在基层实验室，甚至现场进行快速诊断。该方法已经成功地应用于H5和H9亚型AIV的检测。建立一种能够灵敏、特异的H5亚型AI V的RT-LAMP检测方法的前提是需要针对H5HA基因保守区设计得到特异性引物。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种能够灵敏、特异的检测H5亚型禽流感病毒RT-LAMP的引物组；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于H5亚型禽流感病毒检测的RT-LAMP引物组，其特征在于所述的RT-LAMP引物组由一对外引物，一对内引物和一对环引物组成；所述外引物对序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内引物对序列分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述环引物对序列分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

本发明还提供一种检测H5亚型禽流感病毒的方法，其特征在于：使用所述的引物组对待测样品进行RT-LAMP扩增。