[发明专利]鸭出血性卵巢炎病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种鸭出血性卵巢炎病毒毒株，其特征在于，所述病毒毒株命名为黄病毒属鸭出血性卵巢炎病毒HB株，保藏号为CCTCC V201122；所述病毒是ssRNA病毒，有囊膜；病毒颗粒大体呈球状，直径40～60nm；所述病毒对外界环境的抵抗力较强，在4℃中存放几周，在-20℃中存放几个月，其感染力均不受影响；所述病毒对乙醚、氯仿敏感；大多数去污剂能将它迅速灭活；在37℃条件下，用0.1％福尔马林熏蒸6h便可把它灭活；所述病毒不能凝集鸡、鸭、火鸡的红细胞，可以凝集1%鸽红血球。

2.一种鸭出血性卵巢炎灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗由鸭出血性卵巢炎病毒经接种、收获、灭活、浓缩和乳化而得，所述鸭出血性卵巢炎病毒毒株为黄病毒属鸭出血性卵巢炎病毒HB株，保藏号为CCTCC NO：V201122。

3.一种制备如权利要求2所述得鸭出血性卵巢炎灭活疫苗的方法，其特征在于，它将鸭出血性卵巢炎病毒接种于敏感鸭胚，收获含毒鸭胚组织液，经甲醛溶液灭活、浓缩和乳化制得；具体步骤如下：

a. 接种：将鸭出血性卵巢炎病毒经尿囊腔途径按照10²～10⁴ELD₅₀/枚的剂量接种于10～13日龄敏感鸭胚，37℃孵育；

b.收获：收获接种后48～120小时死亡且病痕明显的鸭胚胚体、绒毛尿囊膜和尿囊液，20000r/min捣碎2min，反复冻融2次，存于-20℃即为鸭胚组织液；按照中华人民共和国兽药典、二〇一〇年版三部 附录7规定的半数致死量、半数感染量测定方法，进行病毒含量测定，增殖病毒效价应≥10^6.0ELD₅₀/0.1ml；

c.灭活：向鸭胚组织液中加入质量浓度为37%的甲醛液并使其最终含量达0.08%～0.2%，摇匀，37℃灭活16～36小时或4℃灭活5～7天；

d.乳化：

水相制备: 将上述灭活鸭胚组织液采用3500r/min离心15min、弃沉渣，上清液用无菌0.1M pH7.2 PBS稀释1～3倍，再用50KD膜包进行浓缩至原体积，如此反复2～4次，处理灭活的鸭胚组织液甲醛残留量不大于0.1%，总蛋白含量不大于400μg/ml，按（V/V）4%～6%加入无菌吐温-80，搅拌均匀，即为水相；

油相制备：在进口白油中按（W/V）0.8%～2.0%加入硬脂酸铝，按（V/V）4%加入司本-80，灭菌后即为油相；

将水相和油相按1:1.67～1:3比例混合乳化，即成鸭出血性卵巢炎灭活疫苗，其病毒含量不低于10^6.0ELD₅₀/羽份。

4.一种制备如权利要求2所述灭活疫苗的方法，其特征在于，它将鸭出血性卵巢炎病毒接种于鸭胚成纤维细胞，收获含毒细胞，经甲醛溶液灭活、浓缩和乳化制得；它按如下步骤进行：

a.接种：将鸭出血性卵巢炎病毒细胞适应毒按0.02%～1%的比例接种于鸭胚成纤维细胞单层，

b.收获：接种后72～96小时产生细胞病变（CPE）达到80%～90%时收获细胞，并将盛有收获细胞沉淀的无菌烧杯放在0℃冰浴中用细胞裂解仪于85%功率条件下裂解30s/次，裂解3次，-20℃冻存即为病毒细胞裂解液；按照《中华人民共和国兽药典》（二〇一〇年版三部） 附录7规定的半数致死量、半数感染量测定方法进行病毒含量测定，增殖病毒效价应≥10^6.0TCID₅₀/0.1ml；

c.灭活：向上述病毒细胞裂解液中加入质量浓度为37%的甲醛液并使其最终含量达0.05%～0.12%，摇匀，37℃灭活16～36小时或4℃灭活5～7天；

d乳化：

水相制备: 将上述灭活病毒组织液采用3500r/min离心15min，弃沉渣，上清液用无菌0.1M、pH 7.2的PBS稀释1倍，再用50KD膜包进行浓缩至原体积，如此反复2～4次，灭活的细胞培养液甲醛残留量不大于0.1%，总蛋白含量不大于400μg/ml；并按（V/V）4%～6%加入无菌吐温-80，搅拌均匀，即为水相；

油相制备：在进口白油中按（W/V）0.8%~2.0%加入硬脂酸铝，按（V/V）4%加入司本-80，灭菌后为油相；

将水相和油相按1:1.67～ 1:3比例混合乳化，即成鸭出血性卵巢炎灭活苗，检测其病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀/羽份。