[发明专利]一种制备胱抑素C配对单克隆抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种制备CysC配对单克隆抗体的方法。 

背景技术

胱抑素C(Cystatin C，CysC)即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，分子量13kD，是一种低分子量蛋白质，可由机体所有核细胞产生，产率恒定，循环中的CysC仅经肾小球滤过而被清除。因此，CysC是一种反映肾小球滤过率(GRF)变化的理想的内源性标志物(张耀祖.血清CysC作为肾小球滤过率指标在慢性肾功能衰竭中的意义.现代检验医学杂志，2005，20(6)：72-73.)，其血清浓度测定是优于传统的血尿素、尿酸、肌酐和内生肌酐清除率测定的新的肾功能评价指标。2002年FDA网上公布了26个在检验医学有重大突破的全新检测项目，血清CysC测定便是其中之一。但目前临床试验室测定CysC均为需要昂贵特殊仪器和试剂盒的方法，制约了其推广应用。颗粒增强透射免疫比浊分析法(PETIA)是可以应用于全自动生化分析仪的常用方法(郑瑾，李倩，吴蓉，康向东.PETIA法检测血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C方法学评价.检验医学，2010，25(3)：233-235.)。颗粒增强透射免疫比浊分析法(PETIA)检测CysC的原理是将两种或两种以上能同时与CysC结合的单克隆抗体交联到胶乳颗粒上，这种交联有特异性抗体的胶乳与样本中的CysC结合，聚集成分子量较大的网状结构，形成浊度，根据浊度与CysC的浓度在一定范围内呈正相关的特性，根据校准曲线可以得出待测样品中CysC的浓度。这种检测方法需要CysC标准抗原和抗体。 

CysC在体液中的含量很低，天然提取纯化的CysC极难获得，现在主要通过体外表达的方法制备CysC抗原，用于校准品和抗体的制备。由于CysC抗原分子量小，抗原表位比较集中，要得到针对CysC抗原的不同表位且相互不干扰的单抗(即配对单抗)很困难。 

现有技术中单抗制备方法首先获得尽可能多的单抗细胞株，分别制备纯化的CysC单抗，进行标记，然后通过双抗体夹心ELISA法从中筛选配对的单抗。这种方法工作量大，筛选范围相对较窄，由于CysC是一种分子量很小的抗原，通过该方法很难得到配对单抗。 

发明内容

为了提高获得配对单抗的几率，本发明提供一种CysC抗原及其单克隆抗体的制备方法， 该抗原和抗体可以用于血清CysC的检测。 

本发明建立的一种与现有技术不同的CysC配对单抗制备方法，包括以下步骤： 

将能够产生胱抑素C抗体的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，筛选与胱抑素C具有特异性结合的杂交瘤细胞，制备产单克隆抗体的细胞，完成第1次细胞融合，进一步纯化出单抗，选1个单抗标记辣根过氧化物酶； 

然后实施第2次小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合； 

在酶标板上完成胱抑素C抗原包被，将第2次细胞融合得到的杂交瘤细胞培养上清加到酶标板孔中，并设空白对照孔，随后将上述辣根过氧化物酶标记的单抗加到酶标板孔中，37℃温育30分钟，每孔加入底物进行显色，用硫酸终止反应后，测量450nm下的吸光值； 

选取无抑制的孔作为配对单抗。 

胱抑素C采用原核表达纯化的方法制备。 

更进一步的，本发明的制备胱抑素C配对单克隆抗体的方法，包括：通过两次细胞融合实验筛选配对单抗，第1次融合实验筛选强阳性细胞株(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年8月30日保藏编号CGMCC NO.5191分类命名：杂交瘤细胞)(1-2株)，纯化出单抗，选1株进行辣根过氧化物酶(HRP)标记；第2次融合实验采用间接ELISA法和CysC抗体竞争ELISA法筛选，筛选与第1次融合得到的单抗之间没有竞争抑制作用的阳性细胞株(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日期2011年8月30日保藏编号CGMCC NO.5192分类命名：杂交瘤细胞)(1-2株)，这样的细胞株就是与先获得的细胞株配对的单抗细胞株。该方法筛选对象是一次融合实验的所有阳性孔，筛选范围达到极限，大大提高了获得配对细胞株的几率。