[发明专利]转基因棉花多重PCR-DHPLC检测引物及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因产品的检测，特别是涉及一种转基因棉花多重PCR-DHPLC检测引物及检测方法。

背景技术

目前对转基因棉花的检测方法主要包括常规PCR，实时荧光PCR、PCR-基因芯片等。传统的常规PCR检测方法的扩展性存在一定的局限，随着待检目标的增加，需要对体系中的每套引物的用量及比例重新进行优化，并且兼顾扩增效率等因素，工作量较大；另一方面，通常采用的凝胶电泳分析扩增产物的方法，区分效率不高，检测结果不理想。实时荧光PCR虽然在检测灵敏度等方面较常规PCR检测方法有优势，但是由于目前仪器自身及荧光染料研制的限制，仅能同时提供互不干扰的4个荧光通道，也限制了该技术在检测通量扩展。常规的多套PCR-基因芯片检测方法，需要多套引物进行扩增，操作步骤繁琐，并不适合大规模的高通量检测。变性高效液相色谱技术(Denaturing High-performance Liquid Chromatography，DHPLC)是一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法，分辨率高、扩展性能好、灵敏度高。该技术在50℃条件下分析样品，样品峰的洗脱只由碱基对的数量决定洗脱顺序，当过柱的乙腈浓度提高，核酸片段会根据分子量从小到大的顺序被洗脱出来。通过得到的洗脱峰与marker比较确定分子量大小，判定是否含有目标检测基因，分辨率高。目前，尚没有转基棉花的PCR结合DHPLC的检测技术(PCR-DHPLC)。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于转基因棉花的多重PCR-DHPLC检测的引物。

本发明的另一目的是提供一种基于上述引物的扩展性能好、灵敏度和分辨率高的转基因棉花的PCR-DHPLC检测方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了用于转基因棉花的多重PCR-DHPLC检测的引物，其特征在于：所述引物包括引物对1，以及引物对2、引物对3和引物对4中的至少一对引物；引物对1的上游引物含有Seq ID No.1所示序列，下游引物含有Seq ID No.2所示序列；引物对2的上游引物含有Seq ID No.3所示序列，下游引物含有Seq IDNo.4所示序列；引物对3的上游引物含有Seq ID No.5所示序列，下游引物含有Seq ID No.6所示序列；引物对4的上游引物含有Seq ID No.7所示序列，下游引物含有Seq ID No.8所示序列；

Seq ID No.1：5’-TCCATGCCGCCTCACAAG-3’

Seq ID No.2：5’-CCCAGCCCTCCAAAGATT-3’

Seq ID No.3：5’-TTGAAATTAAAAACCAATGCCAC-3’

Seq ID No.4：5’-GATGTTAGTTTCCCATTCGAGTTT-3’

Seq ID No.5：5’-AACGGGCGGAAACCCTTG-3’

Seq ID No.6：5’-GCAATTACCTTACTGCCAATAAAGC-3’

Seq ID No.7：5’-TGTCATCTATGTTACTAGATCGGGG-3’

Seq ID No.8：5’-GCCGAACGCTGTTATCCTCAT-3’。

需要指出的是，上述Seq ID No.1至Seq ID No.8是与转基因棉花的检测靶标序列互补配对的特异序列，具有很强的特异性识别性。本发明中所述的用于转基因大豆的PCR结合变性高效液相色谱技术检测的引物，在本发明中作为一个不可分割的整体概念，由多对引物对混合而成，具体来说所述引物包括引物对1，以及选自引物对2-4的至少一对引物。其中，各引物对的特异性是本发明所述引物的基础，但本发明所述引物的特异性等其它效果，更重要的还体现在其作为一个整体，其中的各引物对之间的理化特性以及PCR扩增产物之间的统一协调，这也是多重PCR扩增中引物组合配伍的关键与难点。

进一步的，所述引物对1-4的上游引物的5’端还包括Seq ID No.9所示序列，所述引物对1-4的下游引物的5’端还包括Seq ID No.10所示序列；

Seq ID No.9：5’-CGTGGCCTCGCGATCTGACT-3’

Seq ID No.10：5’-CTCAGCGGCGGAGCTACAGA-3’。