[发明专利]用于制定大肠菌群定量曲线的标准样本的制备方法，该定量曲线的制作方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及用于制定定量曲线的标准样本的制备方法，该定量曲线的制作方法及其应用，特别适用于液体样本中大肠菌群的定量检测。

背景技术

常规的大肠菌群计数方法主要包括大肠菌群Petrifilm^TM测试片法、国标GB 4789.3-2010《中华人民共和国国家标准食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》中提到的MPN计数法和平板计数法。这些检测方法耗时较长，工作量大，不利于大肠菌群的快速检测。

目前，开发出许多利用大肠菌群生长过程中酸碱度变化快速检测大肠菌群含量的检测方法。如实时光电微生物快速检测系统，通过向培养中的样本加入酸碱指示剂、并利用比色法监测其pH值的变化，当pH值达到某一阈值时记录检出时间，由检出时间对照定量曲线判断样品中大肠菌群含量。实时光电微生物快速检测系统易操作且耗时较短，仅需6-10小时就可得出检测结果，其中，定量曲线的制作是准确定量的关键所在。定量曲线制作过程中用到标准样本，用目前的方法制备的标准样本都存在样本背景不一致的问题，影响定量曲线的准确性，在最终用于大肠菌群含量的检测时造成不必要的误差。

发明内容

本发明的目的是提供用于制定大肠菌群定量曲线的标准样本的制备方法，使得制备得到的标准样本之间的背景值一致。

本发明的又一目的是提供制作大肠菌群定量曲线的方法，其中标准样本的制备方法使得制备得到的标准样本的背景值一致，可提高大肠菌群定量曲线的准确性。

本发明的另一个目的是提供大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用，提高液体样本中大肠菌群含量检测的准确性。

本发明提供了用于制定大肠菌群定量曲线的标准样本的制备方法，包括以下步骤：取不含大肠菌群的样本，调节pH至6.7±0.2，制成无菌样本。向每毫升无菌样本中加入≥10⁴CFU且≤10¹⁰CFU的活化的大肠菌群标准菌株，并调节pH至6.7±0.2，获得富菌样本；将富菌样本用无菌样本进行十倍递减稀释，待稀释后的富菌样本的理论大肠菌群浓度值≤10CFU/毫升时，停止稀释，制成富菌样本的十倍递减系列稀释液，即为标准样本。

本发明还提供了大肠菌群定量曲线的制作方法，包括以下步骤：根据上述的标准样本的制备方法制备标准样本，标准样本的样本总数≥50个；分别将标准样本按相同的体积比接种到大肠菌群选择培养基中进行培养，并监测接种了标准样本的选择培养基的pH值的变化，待pH值达到设定阈值时，记录标准样本的检出时间；分别利用大肠菌群平板计数法对标准样本中的大肠菌群进行计数，得出每毫升标准样本中大肠菌群数；根据标准样本的检出时间和每毫升标准样本中大肠菌群数的常用对数值绘制大肠菌群定量曲线。

本发明又提供了如上所述大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用，包括以下步骤：取与无菌样本为同种产品的液体样本，调节pH至6.7±0.2，制成液体样本的待检测液；将待检测液按上述体积比接种到大肠菌群选择培养基中进行培养，并监测接种了待检测液的选择培养基的pH值的变化，待pH值达到上述设定阈值时，记录待检测液的检出时间；用待检测液的检出时间对照大肠菌群定量曲线，得出每毫升待检测液中大肠菌群数的常用对数值，并计算每毫升液体样本中的大肠菌群数。

在大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用的一种示意性实施方式中，接种时的体积比为1：1。

在大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用的一种示意性实施方式中，培养的温度为35±1℃。

在大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用的一种示意性实施方式中，通过比色法监测pH值的变化。

在大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用的一种示意性实施方式中，pH值的设定阈值为5.8。

本发明的标准样本制备方法中，通过制备具有相同背景的无菌样本和富菌样本，并将富菌样本用无菌样本进行稀释，制成富菌样本的十倍递减系列稀释液，制成标准样本，使得标准样本的背景值一致。

本发明的制作大肠菌群定量曲线的方法中，利用前述标准样本制备方法制备标准样本，使得制作的大肠菌群定量曲线能更准确地反映检出时间与实际菌落量之间的线性关系，提高了大肠菌群定量检测时的准确性。

本发明的大肠菌群定量曲线在检测液体样本中大肠菌群含量中的应用，使用与液体样本为同种产品的无菌样本、通过特定的方法制定大肠菌群定量曲线，用于液体样本中大肠菌群含量的检测，使得检测结果更为准确。