[发明专利]一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法

说明书

技术领域

本发明涉及病原微生物的检测与鉴定，具体涉及一种利用环介导等温核酸扩增技术快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法。

背景技术

结核病至今仍然是全球范围内对人类健康危害最严重的细菌性传染病之一，据世界卫生组织统计，全世界现有结核病人2 000万,每年新发生约900万例，每年死亡300万人，约1/ 3人群有潜伏性结核分枝杆菌感染。由于人口剧增、移民增加、旅游业发展、耐药性的产生、人类免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒与贫困等原因，结核病呈日益严重回升趋势。

至今，死菌活菌的鉴定，一直是微生物检测的重大难题之一。由于只有活性的结核分枝杆菌才具有传染性和侵袭力，但是目前对结核分枝杆菌的多种检测方法，从涂片镜检为主的微生物学诊断方法（国家标准 GB/T 14926.48-2001），到特异抗原的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法，都均难以进行结核分枝杆菌死活菌的鉴定。目前涂片技术为抗酸染色，死亡的结核分枝杆菌也能被着色，因此无法区分；免疫学检测技术是利用抗原抗体的特异性结合，死亡的结核分枝杆菌仍然具有抗原的一般特性；作为基因诊断的PCR技术，以DNA为检测靶点， DNA在死亡的结核分枝杆菌样本中仍然存在；培养技术虽然能够区分死菌与活菌，但是结核分枝杆菌培养周期长达56日，无法满足目前对快速检测的要求。

叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)是一种只能进入具有不完整细胞膜的死细胞中的DNA分子核酸染料。死细胞暴露于EMA仅需1min的时间，便可以渗透细胞壁或细胞膜与其中的DNA结合，使其不能发生扩增反应。

环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA, 简称LAMP）克服以往基因扩增方法的不足，在恒温条件下能够特异、高效、快速的核酸扩增，具有很多的优点，在63～65℃温度下进行循环链置换反应，0.5至1.5小时即可进行结果判断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将叠氮溴化乙锭与环介导恒温核酸扩增技术相结合快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法，该方法检测时间短、特异性强、灵敏度高、检准率高，适用于临床和疾控部门的检测鉴定。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种快速鉴定结核分枝杆菌死活的方法，包括如下步骤：

（1）样品的预处理：取待检样品，加入终浓度为10至1000μg/mL的叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide，EMA)，暗处放置1~100min；然后暴露在500~1000W的卤素灯下照射10秒~10分钟，此过程在冰浴上进行；所述待检样品为已鉴定含有结核分枝杆菌的样品或分离的结核分枝杆菌；

（2）模板DNA制备：取上述处理过的样品，提取DNA；

（3）恒温基因扩增反应：反应体系为25μl，包括4条特异性引物，1~10mM的dNTPs，1~10mM的MgSO₄，1~10M的甜菜碱，1~5μl 模板DNA，1~8U Bst DNA聚合酶，加蒸馏水至25μl，混匀；于60～65℃下，扩增60～80分钟；

（4）结果判断：在上述反应产物中加入1~2μl显色剂SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若颜色呈绿色则说明样本中存在活的结核分枝杆菌，若颜色呈橙色，则说明样本中不存在活的结核分枝杆菌；

步骤（3）所述特异性引物选自以下5组引物中任一组，其中外引物1的浓度为0.1~10mM，外引物2的浓度为0.1~10mM，内引物1的浓度为1~10mM，内引物2的浓度为1~10mM：

引物组1：

外引物1：TCATCGCCGATCATCAGG（SEQ ID No.1）

外引物2：CGAGTTTGGTCATCAGCCG（SEQ ID No.2）

内引物1：TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT（SEQ ID No.3）

内引物2：TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG（SEQ ID No.4）；

引物组2：

外引物1：ACTACGACCACATCAACCG（SEQ ID No.5）

外引物2：TCAGCGATCGTGGTCCT（SEQ ID No.6）

内引物1：CGGGCACCGTAAACACCGTACGATGGCGAACTCAAGGAG（SEQ ID No.7）