[发明专利]一种适用于转人乙肝表面抗原基因山羊的快速简便检测方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因成分的检测技术领域，具体涉及适用于转人乙肝表面抗原基因转基因山羊的快速简便检测方法。

背景技术

转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提，在安全评价中转基因成分的检测是一项重要内容，建立转基因生物快速、简便、准确的检测方法为安全评价和管理奠定基础。

乙型肝炎(Hepatitis B)是世界上分布最广泛的传染病之一，是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的。而乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)是HBV包膜蛋白的组分，具有良好的免疫原性，且HBV的保护性抗原表位主要集中于HBsAg，目前所研制的所有乙肝基因工程疫苗都是由HbsAg组成。我国已经研制出了转人乙肝表面抗原转基因山羊，转基因动物及其产品市场化是将来发展的必然趋势，因此建立一种快速、简便的检测转人乙肝表面抗原的转基因检测的方法，具有必要性和紧迫性。

综合目前各国对转基因产品的检测技术，根据检测目标，可将其分为以下三个水平：插入的外源基因的检测；插入外源基因的表达产物(RNA或者蛋白质)的检测；插入的外源基因对受体生物基因表达的影响(外源基因的插入对位点附近的基因的影响从而对整个生物体的代谢的影响)的研究，而其中核酸水平的检测应用更为广泛。

核酸水平的检测，主要采用的方法是PCR扩增，即依据转入外源基因的启动子、目的基因、终止子及表达(重组)载体信息，设计特异性引物，进行聚合酶链式反应，依据产物的有无或多少判断是否为转基因产品。PCR检测转基因产品，通常涉及以下技术：定性PCR、定量PCR、巢式PCR、多重PCR、热不对称交错PCR等。

PCR反应具有高灵敏度、高特异性、高效性的特点，是转基因产品初筛阶段的主要检测方法，需要进行PCR扩增和电泳检测两个环节，但必须依赖PCR仪和电泳仪等仪器设备，检测费用高，对检测人员有较高的技术要求，无法在条件较差的基层或现场进行。研发一种不需要设备，是与基层和现场快速检测转基因动物的方法具有重要意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的局限性，提供适用于转人乙肝表面抗原基因山羊的快速简便检测方法，利用环介导等温扩增法原理建立外源基因的快速检测方法，能准确快速检测出转基因山羊中人乙肝表面抗原基因。本发明不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供借鉴。

实现本发明的技术方案如下：

(1)引物设计及合成：根据人乙肝表面抗原(HBsAg)基因(登录号：Genbank：AF223961)设计特异性引物，所述引物的DNA序列如下所示：

FIP：5′-CGAAAGCCCAGGATGATGGGAT-(AAGCTT)-TGCTGTACAAAACCTTCGGA-3′，

BIP：5′-AGATTCCTATGGGAGTGGGCCT-(AAGCTT)-CGAACCACTGAACAAATGGC-3′；

F3：5′-TCCTGCTCAAGGAACCTCTA-3′，

B3：5′-AAACAGTGGGGGAAAGCC-3′；

(2)环介导等温扩增反应

以FIP、BIP为内引物，F3、B3为外引物对人乙肝表面抗原基因进行恒温扩增，其反应体系为：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg²⁺ 1mM，6.4U Bst DNA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补双蒸水至25μl，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200μlEP管中，于90℃反应5min，反应后立即冰浴1-2min，再加入6.4U Bst DNA聚合酶，于63℃反应60min，80℃下反应5min后终止反应；

(3)环介导恒温扩增产物分析

1)琼脂糖凝胶电泳：取2.5μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液(浓度为40％的甘油，0.2％溴酚蓝，59.8％0.25M Tris-HCl)，混匀，再于2％琼脂糖凝胶中电泳30min，得到凝胶成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则判定为含有人乙肝表面抗原基因(即含有转基因成分)，若没有阶梯型条带则判定为不含人乙肝表面抗原基因。